Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск (стр. 6 из 13)
Избыточное количество йода, которое не вступило в реакцию, определяют титрованием тиосульфатом натрия, используя в качестве индикатора крахмал.
Материалы и реактивы: складчатые бумажные фильтры, молоко, 7 %-ный раствор сульфата меди, 2 %-ный раствор гидроксида натрия, 5 %-ный раствор фторида натрия, 0,05 моль/л раствор йода,
5 %-ный раствор соляной кислоты, 0,05 моль/л раствор тиосульфата натрия, 1 %-ный раствор крахмала.
Оборудование: стеклянные палочки, пипетки градуировочные, колбы мерные (объем 50 мл), колбы конические с притертой пробкой (объем 100 мл), воронки стеклянные, бюретки, капельницы, часы.
Ход работы. В две мерные колбы вносят по 5 мл раствора сульфата меди, по 5 мл раствора гидроксида натрия и по 2,5 мл раствора фторида натрия. В одну из них (проба) добавляют 5 мл молока, в другую (контроль) – 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят дистиллированной водой до объема 50 мл, через 30 мин фильтруют. Затем в конические колбы переносят по 20 мл фильтрата пробы и контроля, вливают по 20 мл раствора йода и, непрерывно перемешивая, по 10 мл раствора гидроксида натрия. Тщательно закрывают. Через 20 мин к содержимому колб добавляют по 10 мл раствора соляной кислоты, по три капли раствора крахмала и титруют раствором тиосульфата натрия до исчезновения окраски, образовавшейся при добавлении крахмала.
Массовую концентрацию лактозы в молоке (мг/мл) рассчитывают по формуле
,где А и В – объемы раствора тиосульфата натрия, затраченные на титрование пробы и контроля;
f – коэффициент поправки на титр 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия;
Q – масса лактозы (18,01 мг), эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия;
V0 – общий объем пробы;
V1 и V2 – объемы фильтрата и молока, соответственно, взятые для исследования.
3 БЕЛКИ, ПЕПТИДЫ, АМИНОКИСЛОТЫ
Все белки являются высокомолекулярными полипептидами. Простые белки (протеины) содержат только аминокислоты, а сложные (протеиды) – еще и неаминокислотные компоненты: гем, производные витаминов или углеводные компоненты (Приложения Е-К).
3.1 Лабораторная работа «Определение содержания казеина
в молоке по способу Маттиопуло»
Метод заключается в том, что устанавливают количество децинормального раствора щелочи, затраченное на титрование казеина, зная, что 1 мл децинормальной щелочи эквивалентен 0,11315 г казеина в молоке.
Материалы и реактивы: складчатый бумажный фильтр; молоко цельное; 0,1 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина; 0,04 н раствор серной кислоты; 0,1 н раствор гидроксида натрия.
Оборудование: колбы мерные (объем 100 мл), колбы конические объемом от 200 до 250 мл, капельницы, воронки стеклянные, бюретка, часы.
Ход работы:
1) в две колбы емкостью 200…250 мл отмерить по 20 мл из одной пробы исследуемого молока и добавить 80 мл дистиллированной воды;
2) в одну из колб прибавить из бюретки при постоянном перемешивании по каплям 0,04 н раствор H2SO4 (приблизительно 23…28 мл) до появления хорошо заметных хлопьев казеина;
3) во вторую колбу влить из бюретки такое же количество серной кислоты, как и в первую колбу;
4) содержимое первой колбы отфильтровать в мерную колбу на 100 мл. В фильтрат пройдут через фильтр все составные части смеси, за исключением казеина и жира;
5) смесь во второй колбе (с казеином) оттитровать 0,1 н раствором NaOH с индикатором фенолфталеином (2-3 капли) до слабо-розового окрашивания;
6) 100 мл прозрачного фильтрата перелить в коническую колбу, прибавить 2-3 капли фенолфталеина и так же оттитровать 0,1 н раствором NaOH до слабо-розового окрашивания;
7) вычислить содержание казеина в молоке;
8) на нейтрализацию смеси во второй колбе пошло 14 мл 0,1 н раствора NaOH. На нейтрализацию 100 мл фильтрата из первой колбы без казеина пошло 10 мл 0,1 н NaOH. На нейтрализацию 55 мл фильтрата из колбы без казеина пошло 4 мл 0,1 н раствора NaOH:
55 - 4
61 - х
х = 4,43 мл.
Следовательно, на нейтрализацию казеина из 10 мл молока пошло:
10,0 – 4,43 = 5,57 мл 0,1 н раствора NaOH.
Так как 1 мл 0,1 н раствора NaOH эквивалентен 0,11315 г казеина, то в 10 мл молока содержится:
0,11315·5,57=0,63 г.
В 100 мл молока будет:
0,63·5=3,1 г казеина.
Процентное содержание казеина в молоке:
3,1:1,030 = 3,01 %.
3.2 Лабораторная работа «Определение содержания белка
и казеина в молоке формольным методом»
Метод основан на том, что водный нейтральный раствор аминокислот в присутствии нейтрального формалина способен повышать кислотность с образованием соединений, в которых оба водорода аминогруппы замещены метильной группой.
Далее свободную группу COOH оттитровывают щелочью:
Материалы и реактивы: молоко цельное; 1 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина (1 г фенолфталеина растворить в 70 мл этилового спирта и добавить 30 мл воды); нейтрализованный раствор формалина (приготовление: к 50 мл 30…40 %-ного формалина добавить 0,5 мл 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина и при перемешивании оттитровать 1 н раствором NaOH до слабо-розового окрашивания); 0,1 н раствор NaOH.
Оборудование: колба коническая (объем 100 мл), капельница, бюретка, стакан.
Ход работы:
1) в колбу объемом от 50 до 100 мл отмерить пипеткой 10 мл молока, добавить 10 капель 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина, все размешать и оттитровать 0,1 н раствором щелочи до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании;
2) в колбу добавить 2 мл нейтрализованного формалина, размешать (слабо-розовое окрашивание исчезнет);
3) в бюретке отметить уровень щелочи и содержимое колбы вновь оттитровать до такого же слабо-розового окрашивания (как в первый раз), не исчезающего при размешивании;
4) сделать отсчет по бюретке, показывающий количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшей на титрование смеси в колбе, и рассчитать содержание общего белка и казеина в молоке;
5) для установления содержания общего белка необходимо количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование после добавления формалина, умножить на коэффициент 1,94, а для определения казеина – на коэффициент 1,51.
Пример. После добавления формалина на титрование содержимого колбы пошло 1,7 мл 0,1 н раствора NaOH. Сколько общего белка и казеина в молоке?
Содержание общего белка в молоке (%):
1,7×1,94=3,3.
Содержание казеина (%):
1,7×1,51=2,57.
Факторы, влияющие на точность анализа:
а) неодинаковая интенсивность окраски при титровании до добавления формалина;
б) качество формалина. Используйте только нейтральный и свежеприготовленный формалин!
3.3 Лабораторная работа «Определение аминокислот
формолтитрованием по Сьоренсону»
Метод основан на способности аминокислот реагировать с нейтральным раствором формальдегида с образованием метиленаминокислот. Этот метод применяется для определения карбоксильных групп аминокислот, которые титруют раствором щелочи, предварительно блокировав аминогруппы формальдегидом. Во время реакции с формальдегидом аминогруппа теряет основные свойства, при этом образуется метиленаминокислота, которая оттитровывается щелочью:
Определяя количество карбоксильных групп титрованием, можно одновременно определить и количество α-аминогрупп, так как количество карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных с формальдегидом α–аминогрупп.
Материалы и реактивы: складчатый бумажный фильтр; сухой хлористый барий; 1 %-ная смесь аминокислот (вытяжка аминокислот из биологического материала); 0,1 %-ный спиртовый раствор фенолфталеина; 0,01 моль/л раствор соляной кислоты; 0,05 моль/л раствор гидроксида калия; формольная смесь (к 50 мл 40 %-ного раствора формальдегида добавляют 10 капель 0,1 %-ного раствора фенолфталеина и по каплям 0,1 моль/л раствор гидроксида калия до образования слабо-розовой окраски).
Оборудование: колбы мерные (объем 100 мл), капельницы, воронка стеклянная, бюретка, часы.
Ход работы. К 25 мл смеси аминокислот в колбе прибавляют 1 г хлористого бария, 10 капель раствора фенолфталеина и перемешивают. К смеси приливают насыщенный раствор баритовой воды до появления едва заметного розового окрашивания. Колбу закрывают и оставляют на 15 минут. Затем разбавляют водой до объема 100 мл и отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр от фосфорнокислых и углекислых солей бария. Готовят две колбы объемом 100 мл.
В одну вносят 40 мл фильтрата, что соответствует 10 мл раствора аминокислот, во вторую – 40 мл дистиллированной воды. Прибавляют по 10 капель раствора фенолфталеина и при необходимости раствор соляной кислоты (осторожно) до окрашивания растворов (контроля и пробы) в едва заметный розовый цвет. Затем в обе колбы вносят по 10 мл формольной смеси и титруют из бюретки раствором гидроксида калия до появления едва заметной розовой окраски. Цвет контроля и пробы должен быть одинаковым.
Массовую концентрацию аминокислот (мг/мл) рассчитывают по формуле:
,где А и В – объемы раствора гидроксида калия, затраченные на титрование пробы и контроля, соответственно;