f – коэффициент поправки на титр 0,05 моль/л раствора гидроксида калия;
Q – масса аминокислот, эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора гидроксида калия (0,7 мл);
V – объем раствора аминокислоты, взятый для анализа.
Нарушение факторов, стабилизирующих структуру молекулы белка, приводит к осаждению белков. Так, при кипячении у большинства белков нарушаются связи, свойственные нативному состоянию молекулы. Лучший способ осаждения белков – кипячение в средах, имеющие значение pH, равное изоэлектрической точке белков. Внесение в раствор белка нейтральных солей (сульфата аммония, хлорида натрия и др.) облегчает и ускоряет осаждение при кипячении в результате возникающего дегидратирования белковых частиц.
Минеральные и некоторые органические кислоты, органические растворители осаждают белки в результате денатурации и дегидратации белковых молекул, а также в результате образования комплексных солей белков с кислотами.
Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами (танином, пикриновой, гексациановой, фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой, ферритовой кислотами и их солями) обусловлен образованием нерастворимых соединений этих реактивов с азотистыми группами белка. В таких соединениях алкалоидные реактивы являются анионами, а белки – катионами. Для придания молекуле белка положительного заряда раствор белка подкисляют уксусной кислотой.
В результате этого положительно заряженные частицы белка легко взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами осадителя. Белки, имеющие положительный заряд (протамины, гистоны), хорошо осаждаются алкалоидными реактивами в среде без предварительного подкисления среды инкубации.
Соли тяжелых металлов (меди, ртути, цинка, серебра, свинца) осаждают белки в результате образования комплексных соединений с сульфогидрильными группами белков. Осадок белка в избытке солей некоторых тяжелых металлов (ацетата свинца, сульфата меди) растворяется. Это связано с тем, что избыток ионов этих металлов, адсорбируясь на поверхности белковых частиц, вызывает перезарядку белкового комплекса, в результате чего он переходит в раствор.
В водном растворе большинство белков и их частиц (мицелл) заряжены и гидратированы, что обусловливает осаждение белков в растворах. Но при высокой концентрации средних солей (сульфата аммония, хлорида натрия), молекулы которых в водных растворах гидратированы, происходит разрушение водных оболочек белковых молекул. В результате этого снижается электрический заряд белковой молекулы адсорбирующимися на ней ионами соли, частицы белка слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок.
Материалы и реактивы: 1 %-ный раствор яичного белка; насыщенный раствор хлорида натрия; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; концентрированная азотная и серная кислоты; 20 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты; 10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 10 %-ный раствор пикриновой кислоты; насыщенный раствор танина; 1 %-ный раствор гесоцианоферрата калия (II); 0,1 %-ный раствор сульфата меди; 1 %-ный раствор ацетата меди; 96 %-ный раствор этилового спирта; 95 %-ный раствор ацетона; насыщенный раствор сульфата аммония; кристаллический сульфат аммония.
Оборудование: складчатые бумажные фильтры, стеклянные палочки, пробирки со штативом, капельницы, пипетки, пробирки центрифужные, воронки стеклянные, горелка, водяная баня.
В пробирку вносят 2 мл раствора яичного белка и нагревают на кипящей водяной бане. Наблюдают образование осадка (свертывание белка).
Чтобы сравнить зависимость осаждения белков от концентрации водородных ионов, в пять пробирок помещают по 5 мл раствора яичного белка. Нейтральный раствор белка в первой пробирке нагревают до кипения, он мутнеет, наблюдается опалесценция, обусловленная разрушением гидратной оболочки вокруг молекулы белка, и увеличение белковых частиц. Но мицеллы белка несут заряд и потому остаются в растворе, не попадая в осадок. Раствор во второй пробирке нагревают до кипения, вливают 1 мл раствора уксусной кислоты до слабокислой реакции. Через некоторое время белок выпадает в осадок.
В этих условиях частицы теряют заряд, потому что значение pH среды близко к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку вносят 3 мл раствора уксусной кислоты для создания кислой реакции среды. При кипячении раствора осадок не образуется, так как молекулы белка приобретают положительный заряд, что повышает их устойчивость. В четвертую пробирку добавляют 5 мл раствора уксусной кислоты, 2 мл насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает белый осадок. Его образование обусловлено тем, что белок при взаимодействии с ионами хлорида натрия теряет свой заряд. В пятую пробирку вносят 2 мл раствора гидроксида натрия для создания щелочной среды. При кипячении жидкости осадок не образуется, так как в щелочной среде увеличивается отрицательный заряд белка.
В одну из пробирок вносят 3 мл концентрированной азотной кислоты и по стенкам пробирки осторожно, чтобы жидкости не перемешивались, 3 мл раствора яичного белка. На границе раздела двух жидкостей образуется осадок в виде белкового кольца (проба Галлера). Содержимое перемешивают, доливают избыток азотной кислоты и убеждаются, что осадок не исчезает.
В другую пробирку вносят 3 мл раствора яичного белка и осторожно по стенкам пробирки вливают 2-3 капли концентрированной серной кислоты. Выпадает осадок. Добавляют избыток серной кислоты и наблюдают растворение осадка.
В две пробирки вносят по 5 мл раствора яичного белка. В одну добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в другую – 1 мл раствора сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблюдается выпадения осадка белка.
В три пробирки вносят по 1 мл раствора яичного белка, по 0,5 мл раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую – раствора пикриновой кислоты, во вторую – насыщенного раствора танина, в третью – раствора гексоцианоферрата калия (II). Наблюдают выпадение осадка. При добавлении избытка раствора гексоцианоферрата калия (II) и раствора танина осадок растворяется.
В две пробирки вносят по 3 мл раствора яичного белка, добавляют в первую – 2-3 капли раствора сульфата меди, во вторую – 2-3 капли раствора ацетата свинца. Наблюдают образование осадка (с солью меди – голубого цвета, свинца – белого цвета). При добавлении избытка раствора сульфата меди и ацетата свинца происходит растворение образовавшегося осадка.
В две пробирки вносят по 3 мл раствора яичного белка. В первую – 3 мл этилового спирта, во вторую – 3 мл ацетона. Растворы в обоих случаях становятся мутными. Если к ним добавить по 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия, то через некоторое время белок выпадает в осадок.
В пробирку вносят 3 мл раствора яичного белка и хлорид натрия до полного насыщения, через несколько минут в осадок выпадают глобулины. Смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
В фильтрате содержатся альбумины, которые не осаждаются в данном случае. Если к фильтрату добавить 1 мл раствора уксусной кислоты и нагреть смесь до кипения на водяной бане, то альбумины выпадут в осадок.
В центрифужную пробирку вносят 3 мл яичного белка, 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешивают. Через
5 минут смесь центрифугируют в течение 3…5 мин. Центрифугат, содержащий альбумины, сливают в пробирку, а осадок, содержащий глобулины, растворяют в 2 мл воды. Этот раствор используют для обнаружения глобулинов по биуретовой реакции.
К центрифугату добавляют при перемешивании кристаллический сульфат аммония до полного насыщения раствора, то есть до появления на дне пробирки кристаллов сульфата аммония. В этих условиях выпадают в осадок альбумины. Осадок альбуминов отделяют центрифугированием (3…5 мин при скорости 3000 об-1). Фильтрат проверяют на осаждение белка по биуретовой реакции. Отрицательная биуретовая реакция свидетельствует об отсутствии белка, т.е. о полном осаждении белков из раствора.
Метод диализа основан на способности малых по геометрическим размерам молекул (кристаллоидов) диффузно проникать через полупроницаемые мембраны, а макромолекул (коллоидов) – не проникать. Белки являются высокомолекулярными веществами и не диффундируют через полупроницаемые мембраны (например, коллодиевую или целлофановую пленки). Это свойство белков лежит в основе очистки белков от низкомолекулярных органических и молекулярных примесей.
Материалы и реактивы: целлофановый или коллодиевый мешочки; 1 %-ный раствор яичного белка; 1 %-ный раствор желатина,
10 %-ный раствор азотной кислоты; 1 %-ный раствор нитрата серебра; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди.
Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пипетки, диализатор (или стеклянный стакан объемом 0,5 л), штатив для пробирок.
Ход работы. Вначале с помощью биуретовой реакции определяют, содержит ли исследуемый раствор белок. Для этого к 10 каплям раствора белка добавляют три капли 10 %-ного раствора гидроксида натрия, одну каплю 1 %-ного раствора сульфата меди и полученную смесь тщательно перемешивают. Красно-фиолетовая окраска свидетельствует о наличии в растворе белка.