Целлофановый (коллодиевый) мешочек наполняют на 1/3 объема 1 %-ным раствором исследуемого белка. Мешочек помещают в диализатор, заполненный дистиллированной водой (или в стеклянный стакан с водой), зажимая у верхнего края двумя стеклянными палочками, которые скреплены резиновыми колечками. Через 1,5 ч с диализатом (наружная жидкость) и используемой для диализа дистиллированной водой проводят реакцию на обнаружение хлоридов.
Готовят две пробирки, в одну из них добавляют 1 мл дистиллированной воды, в другую – 1 мл диализата, затем по одной капле
10 %-ного раствора азотной кислоты и 1 %-ного раствора нитрата серебра. В пробирке, содержащей диализат, наблюдают выпадение белого осадка хлорида серебра, а в пробирке с дистиллированной водой такого осадка нет. Делают вывод о том, что при диализе солевого раствора белка хлориды проникли в диализат через полупроницаемую мембрану.
Для проверки содержания белка в первую пробирку добавляют
3 мл диализата, во вторую – 3 мл диализируемой жидкости, а так же по 1 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 1 %-ного раствора сульфата меди (проводят биуретовую реакцию). Содержимое перемешивают и наблюдают красно-фиолетовый цвет в пробирке, содержащей диализируемую жидкость. Такое окрашивание отсутствует в пробирке с диализатом. Делают вывод о том, что белок не проникает через полупроницаемую мембрану.
Определение изоэлектрической точки белков основано на способности белков под действием осадителей, вызывающих дегидратацию белков, при значении pH среды, соответствующем их изоэлектрической точке, легко осаждаться.
Материалы и реактивы: 1 %-ные растворы казеина и желатина; 0,01, 0,1 и 1 моль/л растворы уксусной кислоты; 0,1 моль/л раствор ацетата натрия; 96 %-ный этиловый спирт (или 95 %-ный ацетон); дистиллированная вода.
Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив для пробирок.
Ход работы. В шесть пробирок помещают соответствующие количества (мл) растворов уксусной кислоты, ацетата натрия, дистиллированной воды и овальбумина (яичного белка) согласно данным таблицы 6. Содержание каждой пробирки перемешивают. Затем во все пробирки медленно по стенке доливают по 2 мл спирта (или ацетона). Через 30 мин определяют изоэлектрическую точку. Она будет соответствовать pH пробирки с максимальной степенью помутнения. Далее провести аналогичный опыт с желатином согласно данным таблицы 7.
Таблица 6 – Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования значения рН при выявлении изоэлектрической точки
овальбумина
| Вода | СН3СООН (0,01 моль/л) | CH3COOH (0,1 моль/л) | Раствор казеина (1 %-ный) | рН среды |
| 8,4 | 0,6 | 1,0 | 5,9 | |
| 7,8 | 1,3 | — | 1,0 | 5,6 |
| 8,8 | — | 0,3 | 1,0 | 5,3 |
| 8,5 | — | 0,5 | 1,0 | 5,0 |
| 8,0 | — | 1,0 | 1,0 | 4,7 |
| 7,0 | — | 2,0 | 1,0 | 4,4 |
| 5,0 | — | 4,0 | 1,0 | 4,1 |
| 1,0 | — | 8,0 | 1,0 | 3,8 |
Таблица 7 – Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования рН при выявлении изоэлектрической точки желатина
| Вода | CH3COOH (0,1 моль/л) | СН3СООН (1 моль/л) | CH3COONa (0,1 моль/л) | Раствор желатина (1 %-ный) | рН среды |
| 3,8 | 0,8 | 2,0 | 2,0 | 5,6 | |
| 3,5 | 0,5 | — | 2,0 | 2,0 | 5,3 |
| 3,0 | 1,0 | — | 2,0 | 2,0 | 5,0 |
| 2,0 | 2,0 | — | 2,0 | 2,0 | 4,7 |
| — | 4,0 | — | 2,0 | 2,0 | 4,4 |
| 3,2 | — | 0,8 | 2,0 | 2,0 | 4,1 |
Оформить результаты в табличной форме (таблица 8).
Таблица 8 – Отчетная таблица экспериментальных данных
| Реакции осаждения белков | Яичный белок | Растительный белок |
| Осаждение нагреванием | ||
| Осаждение минеральными кислотами | ||
| Осаждение органическими кислотами | ||
| Реактивы на алкалоиды | ||
| Осаждение тяжелыми металлами (ацетат свинца и сульфат меди) | ||
| Осаждение органическими растворителями (ацетон) | ||
| Осаждение солями (NaCl) | ||
| Осаждение сульфатом аммония | ||
| Диализ солевого раствора белка | ||
| Определение изоэлектрической точки белков |
Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну.
Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.
Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента.
В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4).
4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы
солода по методу Вольгемута»
Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности.
Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.
Материалы и реактивы: вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия.
Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат.
Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.
Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.
Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки
(А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).