Определение общего количества микроорганизмов
При определении общего количества микроорганизмов в молоке рекомендуются следующие нормы разведения:
hМолоко сырое - 1:10000; 1:100000; 1:1000000.
hМолоко пастеризованное - 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000.
Чтобы получить разведение 1:10 пробирку с продуктом, предназначенным для исследования, и пробирку со стерильной водой берут в левую руку и держат в наклонном положении между большим и указательным пальцами. Ватные пробки из пробирок вынимают около пламени горелки и помещают одну между средним и безымянным пальцами левой руки, а другую захватывают мизинцем правой руки, после чего обжигают края обеих пробирок и вводят, стерильную пипетку в пробирку с исследуемым материалом. Набирают 1 мл и переносят в пробирку со стерильной водой. Содержимое выдувают и еще несколько раз набирают из этой же пробирки воду, промывают пипетку, чтобы на стенках ее не осталось материала, предназначенного для исследования. Вынимают пипетку, обжигают края пробирки, внутренние концы пробок и затем закрывают ими пробирки. Для дальнейшего разведения берут другую стерильную пипетку и, набрав 1мл из пробирки с 1 разведением, переносят его во вторую пробирку со стерильной водой. Получается разведение 1:100. Новой стерильной пипеткой делают следующее, 3 разведение и т.д.
По 1мл соответствующих разведений высеивают в чашки Петри и заливают горячей питательной средой температурой 45°С (сусло-агар, МПА) в количестве 12-15мл. Сразу после заливки содержимое тщательно перемешивают путем легкого покачивания для равномерного распределения посевного материала. Выращивание ведут в течение двух суток при температуре 37°С.
Для определения общего количества бактерий следует выбирать те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 50 и не более 300 колоний. Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном (без крышки) на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 8-10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться счетчиками. При большом числе колоний и их равномерном распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают число колоний в двух-трех секторах, находят среднее арифметическое число колоний для них и умножают на общее количество секторов всей чашки.
Таким образом, находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.
Для подсчета общего количества бактерий в 1 мл или 1 г образца число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение. Полученные результаты по отдельным чашкам складывают, делят на количество подсчитанных чашек и выводят среднее арифметическое, которое принимают за окончательный результат. Полученные числа округляют.
Проба на редуктазу
Для определения бактериальной чистоты и свежести молока проводят пробу на редуктазу, основанную на способности бактерий выделять редуктазу, восстанавливающую краски (метиленовый синий, резазурин). Обесцвечивание мителенового синего и резазурина наступает тем быстрее, чем больше микробов в молоке. По скорости обесцвечивания краски молоко разделяют на 4 класса (таблица 10).
| Показатель | Класс | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Время восстановления | Более 5,5ч | 5,5-2ч | 2ч 20мин | Менее 20мин |
| Качество молока | Хорошее | Среднего качества | Плохое | Очень плохое |
| Количество микроорганизмов в 1мл молока | Менее 500тыс. | От 500тыс. до 4млн. | От 4млн. до 20млн. | Более 20млн. |
Постановка пробы
В пробирки наливают 20мл молока и 1мл метиленового синего или 10мл молока и 0,5мл метиленового синего. После тщательного смешивания пробирки помещают в водяную баню или термостат при температуре 38-40°С. Такую температуру поддерживают в течение всего опыта до полного обесцвечивания молока. Первые 20мин наблюдения ведут непрерывно, в дальнейшем просмотр пробирок производят периодически через каждые 15-ЗОмин.
Приготовление раствора метиленового синего
5мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего прибавляют к 195мл дистиллированной воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения полученного раствора не более 7 суток.
Метод широко используется ввиду простого выполнения и быстрого по
лучения результатов.
Редуктазная проба с резазурином
В стерильные пробирки вносят по 1мл рабочего раствора резазурина и по
10мл исследуемого молока, закрывают корковыми пробками, смешивают путем
трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в водяную баню
с температурой воды 38°С и защищают от действия прямых солнечных лучей.
Время погружения пробирок в водяную баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 минут и через 1 час, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Через 20 минут пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из водяной бани. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывается. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и оставляют в бане до конца анализа. В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов:
| Класс | Качество молока | Продолжительность изменения цвета | Цвет молока | Количество бактерий в 1 мл молока |
| 1 | Хорошее | Через 1 ч | Сине-стальной | Менее 500 тыс. |
| 2 | Удовлетвори-тельное | Через 1 ч | Сиреневый или сине-фиолетовый | От 500 тыс. до 4 млн. |
| 3 | Плохое | Через 1 ч | Розовый или белый | От 4 млн. до 20 млн. |
| 4 | Очень плохое | До 20 мин | Белый | Свыше 20 млн. |
Определение антибиотиков в молоке
Антибиотики (пенициллин, тетрациклин, стрептомицин и др.) попадают в молоко при лечении мастита у коров. Они нарушают молочнокислое брожение. Для установления наличия антибиотиков и моющих или дезинфицирующих средств в молоке используют прямые и косвенные методы.
Метод прямого микроскопирования. Метод основан на подавлении размножения бактерий и изменении их формы под действием антибиотиков.
В пробирку отбирают 10мл исследуемого молока, закрывают корковой пробкой и помещают в водяную баню при температуре 8О-85°С на 5 минут. Затем быстро охлаждают до 40°С. В контрольную пробирку отбирают 10мл молока, которое заведомо не содержит антибиотиков. В обе пробирки добавляют по 3-4 капли свежей культуры, чувствительной к антибиотикам, термофильного стрептококка, выращенного на гидролизованном или обезжиренном молоке. Тщательно встряхнув закрытые пробками пробирки помещают в водяную баню при температуре 40°С на 90 минут. Затем микроскопируют окрашенные препараты с иммерсионным объективом. На присутствие антибиотиков указывает резкое уменьшение количества клеток в испытуемом молоке по сравнению с контролем, наличие утолщенных форм клеток и их скопление.
Метод восстановления индикаторов
а) Использование метиленового синего.
В пробирки с исследуемым и контрольным молоком вносят по 1мл раствора метиленового синего и затем 3-4 капли свежей культуры чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка. Встряхнув, пробирки ставят в водяную баню при температуре 38-40°С на 5,5 часов. Следят за изменением цвета в исследуемом образце по сравнению с контролем, который должен восстанавливаться. Наличие синего цвета в исследуемом молоке указывает на присутствие антибиотиков.
б)Использование резазурина.
В пробирки с исследуемым и контрольным молоком вносят по 1мл раствора резазурина; 3-4 капли чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка, перемешивают и ставят в водяную баню на 45 минут. Отмечают изменение цвета исследуемого образца по сравнению с контролем. Фиолетово розовый или сине-стальной цвет молока указывает на присутствие антибиотиков.
Вопросы для самопроверки
1 Источники попадания микрофлоры в молоко.
2 Значение микробиологического контроля в молочной промышленности.
3 Отбор молока для бактериологического исследования.
4 Методы определения общего количества микроорганизмов.
5 Метод определения эффективности пастеризации.
6 Определение молочнокислых бактерий в молоке.
7 Определение дрожжей и плесневых грибов в молочных продуктах.
8 Показатели для определения категории молока.
9 Какие молоко и сливки называют питьевыми?
10 С какой целью охлаждают молоко?
11 Что такое пастеризация и стерилизация? Чем они отличаются?
12 Какие микроорганизмы выдерживают режимы пастеризации
13 Назовите пороки питьевого молока.
14 Как контролируют производство пастеризованных молока и сливок?