Иногда каплю суспензии, содержащую одну спору, помещают на стерильное стекло в чашку Петри и добавляют в нее кусочек агаризованной среды; после обрастания его мицелием гриба культуру переносят в пробирку или чашку Петри.
Возможно использование и других методов получения моноспоровых культур, которые указаны в специальной литературе [4, 6, 8].
Поддержание и хранение чистых культур
После выделения культур и своевременной их очистки от посторонних организмов следует поддерживать чистые культуры в жизнеспособном состоянии. Простейший способ поддержания – пересев их через определенное время в пробирки на косяки свежей агаризованной среды. Периодичность пересевов зависит от вида гриба и определяется временем его выживаемости. При пересевах переносят, главным образом, споры, а у неспорообразующих форм – мицелий из краевой зоны колонии. Следует учитывать, что длительное выращивание грибов на искусственных средах может привести к изменению свойств культуры, в частности, к потере патогенности, снижению агрессивности и вирулентности.
Для хранения выбирают лучшие из имеющихся культур. Культуры сохраняют при комнатной температуре или в холодильнике при температуре 4 °С. Пересевы (если культура хранится в холодильнике) делают реже.
При хранении в пробирках обжигают снаружи пробки и оборачивают пергаментной бумагой (фольгой, полиэтиленом и т.д.).
Периодичность пересева зависит от вида гриба. Грибы родов Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, пересевают через 3 месяца, рода Phytophthora – каждые 3 недели.
Все культуры должны быть подписаны с указанием даты пересева. Хранить их нужно в разных местах в нескольких повторностях. Культуры необходимо периодически просматривать (во избежание попадания клещиков).
Для длительного хранения грибов лучше использовать бедные сахарами крахмальные и целлюлозные среды.
Сохранять культуры грибов можно также под минеральным маслом, в лиофилизованном состоянии (после удаления воды из замороженных суспензий под вакуумом) и в жидком азоте в ампулах.
Все культуры должны быть пронумерованы и зарегистрированы в специальных журналах, карточках, в которых записывают номер и название культуры, где и откуда она выделена, дату выделения, способ выделения, название сред, примененных при пересевах, результаты наблюдений за ростом патогена в чистой культуре и отмеченные при этом особенности.
Задание:
1. Подготовить и простерилизовать чашки Петри и пробирки.
2. Установить вид патогена на пораженном органе растения, используя определители.
3. Продезинфицировать и поместить пораженные части растения во «влажную камеру».
ЗАНЯТИЕ 2
Тема: Питательные среды и правила их приготовления
Цель: Ознакомиться с типами и назначением питательных сред, приготовить необходимые для дальнейшей работы среды.
Оборудование: Микроскоп, пенал с набором инструментов, весы, воронки, колбы 1 л, флаконы, марля.
Реактивы: Агар-агар, овсяные хлопья, картофель, глюкоза, минеральные соли для среды Чапека.
Для получения чистых культур грибов (факультативных сапротрофов и факультативных паразитов), поддержания их жизнеспособности в целях дальнейшего изучения применяют различные питательные среды. По консистенции различают жидкие и плотные питательные среды. Выбор того или иного типа питательного субстрата зависит от потребностей грибного организма и целей проводимого эксперимента.
Плотные среды готовят, добавляя к растворам солей и отварам агар (2-2,5%) или желатин (10-15 %), а, в случае необходимости, увлажняют поверхность твердых предметов (опилки и т.д.) растворами питательных веществ.
Плотные среды используют для выделения грибов из естественных субстратов, получения культур из отдельных спор (моноспоровые изоляты), определения репродуктивной способности и особенностей спорообразования, дифференциации грибов по характеру роста на плотных средах, изучения влияния факторов среды и различных веществ на рост грибов.
Сыпучие среды (зерно, отруби) используют для приготовления больших количеств спорового посевного материала.
Приготавливая среды, надо иметь в виду следующие обстоятельства:
1) грибы обычно растут лучше на среде, богатой углеводами, но выращивание их на таких средах длительное время может редуцировать споруляцию;
2) большинство грибов предпочитает слабокислую реакцию (pH 6,0-6,5);
3) углеводы и белки в кислых и щелочных растворах разрушаются при нагревании, поэтому они должны быть умеренно стерилизованы или добавлены отдельно;
4) агар растворяют в половинной норме воды в течение 1-2 ч, а питательные вещества – в оставшейся воде, после чего компоненты смешивают;
5) агаризованная среда не затвердевает, если pH смещено в кислую или в щелочную сторону;
6) пептон, в основном, может быть исключен из состава сред, предназначаемых для грибов;
7) водопроводную воду следует предпочесть дистиллированной, поскольку первая содержит полезные микроэлементы; для грибов рода Phytophthora лучше использовать дистиллированную воду;
8) для сред, в состав которых входит растительный материал, из него предварительно делают вытяжку при низких (картофельный агар) или высоких (картофельно-декстрозный агар) температурах.
Жидкие питательные среды применяют для качественного и количественного изучения потребностей грибов в питательных веществах в процессах роста и синтеза метаболитов. В таких средах определяют влияние pH среды, микроэлементов, стимуляторов, ингибиторов и других веществ на биосинтетическую активность гриба.
Для подкисления сред употребляют соляную, серную, лимонную, молочную, фосфорную кислоты, для подщелачивания – NaOH или KOH.
Для усиления роста грибов и повышения их биосинтетической активности в питательные среды вводят микроэлементы. Железо, цинк, марганец и др. применяют в растворенном виде.
В качестве факторов роста используют тиамин, биотин, реже инозин, пиридоксин и др. Готовят исходные растворы этих соединений в 20-% -ном спирте, стерилизуют кипячением на водяной бане и хранят в холодильнике. Исходные растворы тиамина и пиридоксина должны содержать 100 мкг/мл; биотина – 5 мкг/мл.
Среди жидких сред наиболее распространенной и употребимой является среда Чапека (табл. 1) с pH 7,0. Можно заменять сахарозу глюкозой, NaNO3 – NH4Cl, доводить pH до 6,6 и ниже, употреблять водопроводную воду. Компоненты среды последовательно растворяют в воде, вносят агар-агар и расплавляют его. Затем добавляют сахарозу, устанавливают pH = 7,0. Среду разливают в посуду и стерилизуют 30 мин при температуре 117 °С (или 20 мин при 121 °С).
Таблица 1
Состав питательных сред для выращивания фитопатогенных грибов
| Название питательной среды | Состав компонентов на 1 л воды, г | Группа культивируемых грибов | |
| 1 | 2 | 3 | |
| Агаризованная среда («голодный агар») | Агар (15-20) | Большинство видов (для получения спороношения) | |
| Зерновой агар | Кукуруза (30), агар (20) | Phytophthora, Pythium | |
| Картофельно-глюкозный агар | Картофель (200), глюкоза (100), агар (20) | Venturia, Monilia, Botrytis | |
| Картофельно-сахарозный агар | 1000 мл картофельного экстракта (1800 г картофеля на 4500 мл воды), сахароза (40), агар (40) | Fusarium | |
| Картофельно-декстрозный агар | Картофель (200), декстроза (20-50), агар (20) | Головневые | |
| Картофельный агар | Картофель (200), агар (20) | Fusarium, Phytophthora | |
| Мальц-пептонный агар | Солодовый экстракт или мальц-экстракт (20), пептон (10), лимонная кислота (0,5), агар (20) | Фитопатогенные и почвенные грибы, паразиты семян | |
| Минеральный раствор Петри | Нитрат кальция (0,40), сульфат магния (0,15), фосфат кислого калия (0,15), хлорид калия (0,06) | Phytophthora (для получения спорангиев) | |
| Овсяный агар | Овес (100) или овсяные хлопья (150), агар (20) | Clasterosporium, Fusarium | |
| Синтетический агар Чапека | Сульфат магния (0,5), безводный фосфат калия (1,0), хлорид калия (0,5), сульфат железа (0,01), нитрат натрия (2,0), декстроза (30), агар (20), вода дистиллированная | Почвенные патогены и разрушители древесины, большинство видов грибов | |
| Среда Барнеса | Фосфорнокислый калий (1), аммоний азотнокислый (10), азотнокислый калий (1), глюкоза (1), агар (20) | Сумчатые (для получения плодовых тел) | |
| Сусло-агар | Неохмеленное 7 %-ное пивное сусло (1000) вместо воды и агар (20) | Большинство фитопатогенов | |
Правила приготовления и стерилизации питательных сред
Предварительно приготовленный картофельный (200 г картофеля режут ломтиками и варят в 1 л воды до готовности) или овсяный (150 г овсяных хлопьев варят в 1 л воды) отвар вливают в мерную посуду, фильтруют, добавляют агар и доводят объем до 1 л. Устанавливают нужное значение pH. Для стерилизации среду разливают в колбы, флаконы, пробирки не более, чем наполовину. Пробки (ватно-марлевые) закрывают плотной бумагой и помещают в автоклав.