Методические указания к занятиям спецпрактикума по разделу (стр. 5 из 8)
где А – величина одного деления окуляр-микрометра, мкм;а – количество делений объект-микрометра;
в – количество делений окуляр-микрометра;
10 мкм – цена одного деления объект-микрометра.
Для каждого окуляра и объектива вычисляют цену деления в данном конкретном случае. Для удобства работы обычно заготавливают таблицу, в которой приведены значения деления окуляр-микрометра для всех возможных оптических комбинаций, а также результаты умножения этой единицы на ряд последовательных чисел до 20 и более. Таблицу обычно помещают на внутренней части дверцы футляра микроскопа.
Задание:
1. Установить цену деления окуляр-микрометра.
2. Описать морфологические структуры и культуральные свойства изучаемых микромицетов по приведенному плану.
ЗАНЯТИЕ 4
Тема: Изучение вегетативных и репродуктивных функций грибов.
Цель: Ознакомиться с особенностями роста и развития грибов под влиянием различных факторов среды и условий культивирования.
Для роста грибов необходимые следующие факторы:
– источники питания (натуральные и искусственные);
– неорганические соединения, содержащие Na, K, Ca, Mg, S, Fe, P, C, H, N;
– микроэлементы: Mn, B, Co, Mo, Zn;
– стимуляторы роста;
– условия оптимальных температур, кислотности, влажности, освещенности, степени аэрации и др.
Грибы, являющиеся облигатными паразитами, факультативными сапротрофами, культивируются на живых растениях или их частях (ржавчинные, мучнисторосяные, пероноспоровые).
Естественные питательные субстраты неопределенного состава, искусственные субстраты определенного состава содержат необходимые элементы в усвояемой форме. Используют кусочки овощей, плодов, мелко нарезанные ветви и стебли растений, зерно в натуральном виде или в виде экстрактов, настоев или отваров (пивное сусло, дрожжевая вода, кукурузный, картофельный экстракты), добавляемые к искусственным питательным средам.
Питательные вещества усваиваются микроорганизмами только при определенной кислотности питательной среды, так как проницаемость оболочки клеток зависит от этого фактора. Большинство грибов развивается при pH 4,5-6,0. Реакция среды в процессе роста культуры грибов может значительно изменяться. Каждая стадия развития гриба (прорастание спор, рост мицелия, спорообразование) требует определенных значений pH. Грибы одних родов вызывают подщелачивание среды (Fusarium), другие – подкисляют среду (Phytophthora).
Температура выращивания. Минимальная температура для развития грибов – 0-5 °С, оптимальная температура отличается в зависимости от вида. Например, для грибов р. Fusarium – 28-30 °С, Phytophthora infestans – 15-20 °С, Botrytis cinerea – 24-25 °С.
Освещенность. При недостаточном освещении наблюдается задержка спорообразования. При УФ-освещении прекращается рост и ферментативная активность грибов. Прямые солнечные лучи отрицательно влияют на рост грибов и их активность при длительном хранении.
Измерение линейного роста колоний
Для определения линейного роста измеряют диаметр колонии (от места посева до конца зоны роста мицелия), растущих на плотной среде, обычно в чашках Петри с одинаковым слоем среды, через определенные промежутки времени. В некоторых случаях измерение производят в специальных пробирках с застывшим горизонтальным слоем плотной среды равномерной толщины.
Изучаемый гриб высевают в центр поверхности плотной питательной среды по возможности немногочисленым инокулюмом всегда одной плотности, особенно при изучении влияния условий культивирования на рост колоний.
Диаметр колонии измеряют в двух взаимноперпендикулярных направлениях в двух-трех повторностях через определенные промежутки времени (каждые 24 ч). Количество измерений зависит от скорости роста гриба, оно больше у быстрорастущих видов. Результаты измерений изображают графически в равномерной или логарифмической шкале.
Линейный рост гриба определяют на благоприятной среде при изучении влияния различных факторов среды.
Радиальная скорость роста колонии вычисляется по формуле:
(2)где Kr – радиальная скорость роста колонии, мм/ч;
r – радиус колонии в данный момент времени, мм;
r0 – радиус колонии в начальный момент времени, мм;
t – время от момента посева до того момента, когда радиус колонии достигнет r, час.
Определение интенсивности плодоношения и спорообразования грибов
Интенсивность плодоношения (спорообразования) грибов характеризует их репродуктивную способность, играет важную роль в распространении и реализации их жизненной стратегии. У фитопатогенных грибов интенсивное спорообразование обусловливает высокий инфекционный потенциал возбудителей заболеваний.
Интенсивность спорообразования (т.е. увеличение числа спор) при росте гриба на плотной среде определяют с помощью счетной камеры или в нескольких полях зрения микроскопа по количеству спор в определенном объеме взвеси.
Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, на котором вышлифована пластинка, поверхность которой обычно на 0,1 мм ниже поверхности всего стекла. На такой пластинке выгравирована система взаимоперпендикулярных линий, расстояние между которыми равно 50 μ. Квадраты, образуемые пересечением таких линий, имеют сторону, равную также 50 μ, или же, что одно и то же, 1/20 мм. Объем такой «жидкой призмы» равен 1/4000 мм3 (1/20 ×0,1 ×1/20 мм3). Необходимо помнить, что 1 мм3 в 4000, а 1 см3 – 4000000 раз больше объема одной призмы. Если жидкость представляет собой взвесь спор, то исходя из вычисленных единиц объема, можно подсчитать, сколько находится спор или конидий в любой единице жидкости, а потом и во всей жидкости, если ее объем установлен. Иногда для этих целей пользуются камерами Горяева, Тома, Фукс-Розенталя, Нейбауера, сеткой Предтеченского и т.д. В камере Тома и сетке Предтеченского очерченная на пластинке площадь равна 1 мм2. На каждой камере имеется ее цифровое значение, и на это необходимо обращать внимание.
Практически количество конидий или отдельных клеток вычисляют по формуле:
X = а × в × 4000, (3)
где X – количество искомых клеток в 1 мм3;
а – количество клеток в определенном объеме камеры;
в – количество сосчитанных квадратов.
Если пересчет ведется на 1 см3 , то умножают на 4000000. Подсчет проводят или в каждом квадрате, или же в квадратах, расположенных по диагонали. Если подсчет ведут в очень разбавленных смесях, то за единицу поверхности берут не только один квадрат, а всю камеру. Для большей точности подсчитывают конидии не в одной, а в нескольких каплях исследуемой взвеси. Результаты обрабатывают статистически. Для того, чтобы определить количество спор (конидий), которые гриб образует на единицу площади спороносящей поверхности, с помощью пробочного сверла или скальпеля вырезают определенный участок ткани растения и смывают с него споры 1 мл воды.
(4)где I – интенсивность спорообразования, шт / см2;
N – среднее количество спор в малом квадрате счетной камеры, шт;
S – площадь вырезанной спороносящей поверхности, см2;
L – объем воды, которой смыты споры, мл;
V – объем малого квадрата камеры, мл.
При поверхностном или погруженном культивировании в жидкой питательной среде интенсивность спорообразования определяют по количеству конидий в определенном объеме культуральной жидкости. Пробу культуры, помещенную в жидкую среду, встряхивают на аппарате в течение 15-30 мин и центрифугируют. Время осаждения спор зависит от вида гриба и определяется экспериментально. Из определенной навески осадка спор готовят взвесь и в счетной камере подсчитывают число спор в единице объема.
Интенсивность спорообразования определяют по количеству пустул, клейстотециев, перитециев, апотециев, ложе, пикнид – на 1 см2 пораженной ткани. Определяют в 3-х предварительно ограниченных местах на 10-ти очажно пораженных органах (например, клейстотеции возбудителей мучнистой росы в 3 точках листа на 10 листьях) количество плодовых тел на единицу поверхности по формуле:
(5)где N – количество пустул, клейстотециев, перитециев, апотециев, ложе, пикнид на 1 см2, шт / см2;
Σ n – общее количество пустул, клейстотециев, перитециев, апотециев, ложе, пикнид, шт;
Σs – общая площадь, на которой проведен учет, см2 .
Для гифальных грибов интенсивность спорообразования определяют по количеству спор на 1 см2 спороносящей поверхности.
Определение жизнеспособности патогена
При определении количества жизнеспособных спор, образовавшихся на поверхности пораженных органов, а также анализе популяции патогена пользуются методом рассева определенного объема суспензии инокулюма определенного объема суспензии инокулюма на агаровой среде. Такую среду готовят из экстракта поражаемых тканей растения-хозяина.
Для приготовления суспензии на 25 мл стерильной воды берут 10 проб и 10 типично пораженных органов общей площадью в 1 см2 Вырезанные кусочки пораженных тканей помещают в колбу со стерильной водой и тщательно встряхивают. Полученную суспензию сливают в чистую колбу, откуда берут по 0,1 мл для рассева на агаризованную среду, разлитую в чашки Петри. Суспензию наносят на поверхность среды стерильной пипеткой в виде капель и равномерно распределяют с помощью простерилизованного шпателя.