Пункты учета и отлова выбираются в соответствии с возможностью изучения относительной численности и видового состава мелких млекопитающих в совокупности с наибольшим числом доступных стаций (открытых и закрытых лугополевых, лесокустарниковых, околоводных). В выбранных стациях в вечерние часы зоологами выставляются линии из больших или малых ловушек. В утренние часы следующего дня производится выемка мелких млекопитающих из ловушек, учет и упаковывание в тканевые мешочки или прочные одноразовые полиэтиленовые пакеты (каждая особь в отдельную упаковку).
Далее в лаборатории ООИ проводят вскрытие зверьков в следующем порядке. При вскрытии животных под контролем опытного зоолога проводится определение возрастного и полового состава добытых особей, их репродуктивной активности, уточнение видовой принадлежности. Для проведения лабораторных исследований на хантавирусы от каждого зверька в стерильные одноразовые пробирки (типа "Эппендорф") отдельно отбирают: легкое, сердце, печень, полоску фильтровальной бумаги, пропитанную кровью из грудной полости или сердца. Пробирки нумеруются согласно протоколу вскрытия и замораживаются в сосуде Дьюара (в жидком азоте) или в сумке-холодильнике с сухим льдом.
С целью предотвращения контаминации место разреза перед вскрытием зверька тщательно протирают одноразовым ватно-марлевым тампоном, обильно смоченным 96%-ным спиртом. Во время вскрытия зверьков используют два набора стерильных пинцетов и ножниц. Одним набором делают разрез кожи и подкожной клетчатки, вторым - брюшной и грудной стенок, отбор частей легкого, печени и сердца. После вскрытия каждого зверька оба набора инструментов тщательно протирают ватно-марлевым тампоном, пропитанным антисептиком, и стерилизуют в пламени спиртовки.
При исследовании полевого материала методом ПЦР готовят суспензии органов, для чего кусочки ткани размером 1 - 2 см растирают стерильно пестиком в фарфоровой ступке, постепенно добавляя 1 - 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида. Для каждого образца используется стерильный инструментарий и отдельный набор из пестика и ступки. Для выделения РНК используют 150 мкл суспензии, остаток материала замораживают и сохраняют при температуре минус 20 °C до конца исследования.
4.4. Упаковка, условия хранения и транспортирования материалов для проведения лабораторной диагностики ГЛПС должны соответствовать требованиям нормативных методических документов.
Все материалы, доставляемые для исследования в лабораторию, должны быть герметично упакованы в плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками, помещенными в полиэтиленовый пакет с ватой (или другим гигроскопичным материалом). В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименования направляющего учреждения, Ф.И.О. больного, его возраста и местожительства, предварительного диагноза, вида материала, даты и времени взятия материала. Все пробирки, флаконы и прочие емкости должны быть маркированы в соответствии с направляемым списком. Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоконтейнер (термос) с охлаждающими элементами или пакетами со льдом.
4.5. После забора клинического материала в больничном стационаре образцы крови с консервантом доставляются в ПЦР-лабораторию в охлажденном состоянии не позднее 12 ч с момента взятия, образцы плазмы - не позднее 2 сут. (при температуре не выше 2 - 4 °C). При транспортировании и хранении материалов следует избегать повторного размораживания проб. При необходимости образцы полевого и клинического материалов (суспензии органов и плазму крови) можно хранить в течение 3 - 6 мес. при температуре не выше минус 20 °C.
5. Рекомендуемые наборы реактивов, оборудования
и расходных материалов для проведения анализа методом ПЦР
5.1. На этапах подготовки проб для исследования и анализа результатов ПЦР необходимо использовать только сертифицированные наборы реактивов (Прилож. 3). Использование сертифицированных тест-систем и наборов реактивов возможно только для научных целей.
5.2. При проведении ПЦР-исследований рекомендуется использовать оборудование и расходные материалы, перечень которых приводится в МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности".
6. Схема проведения ПЦР-исследований полевого
и клинического материала на наличие хантавирусов
Для исследований полевого и клинического материала методом ПЦР применяется традиционная схема анализа, включающая экстракцию РНК, обратную транскрипцию, постановку ПЦР и учет результатов. Требования и рекомендации по использованию необходимых наборов реактивов, оборудования и расходных материалов для проведения ПЦР-исследований приведены выше (п. п. 5.1, 5.2).
6.1. Описание методики выделения РНК из плазмы крови. РНК из плазмы
крови выделяют методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата. Для
этого в каждую пробирку вносят по 450 мкл лизирующего раствора (в состав
которого входят: гуанидинтиоцианат - 5,2 М; динатриевая соль
этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na -ЭДТА - 12,5 мМ;
2
трис-(оксиметил)-аминометан-гидрохлорид-трис-HCl - 10 мМ; тритон Х-100 -
2%) и добавляют 100 мкл исследуемого образца, используя наконечники с
аэрозольным барьером. Плотно закрытые пробирки с пробами тщательно
перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об./мин.
на микроцентрифуге для удаления капель. В каждую пробирку отдельным
наконечником добавляют по 30 мкл ресуспендированного сорбента,
представляющего собой 40%-ную суспензию силикагеля в деионизованной воде, и
оставляют в штативе на 5 мин., периодически встряхивая содержимое на
вортексе. Для осаждения сорбента все пробирки центрифугируют при 10 тыс.
об./мин. в течение 30 с на микроцентрифуге. Затем проводят удаление
супернатанта, используя для этого вакуумный отсасыватель и отдельный
наконечник для каждой пробы. Далее в каждую пробирку добавляют по 400 мкл
раствора для отмывки (состоящего из: гуанидинтиоцианата - 5,0 М; Na -ЭДТА -
2
0,0125 М; трис-HCl - 0,01 М), перемешивают на вортексе до полного
ресуспендирования сорбента и центрифугируют 30 с при 10 тыс. об./мин.
Удаляют супернатант, как описано выше. Добавляют в пробирки по 500 мкл
70%-ного раствора этилового спирта, тщательно ресуспендируют сорбент на
вортексе и центрифугируют 30 с при 12 тыс. об./мин. После удаления
супернатанта повторяют отмывку спиртом аналогичным способом. Добавляют в
пробирки по 400 мкл ацетона, тщательно ресуспендируют сорбент на вортексе и
центрифугируют 30 с при 10 тыс. об./мин. После тщательного удаления
супернатанта из каждой пробирки их помещают с открытыми крышками в
термостат при температуре 60 °C на 7 мин. для подсушивания сорбента.
В заключение в пробирки добавляют по 50 мкл раствора для элюции
(трис-HCl 0,01 М; Na -ЭДТА - 0,001 М) и прогревают в термостате при 56 °C в
2
течение 7 мин., периодически встряхивая на вортексе. Центрифугируют
пробирки при 12 тыс. об./мин. в течение 2 мин. Полученный супернатант
используют для постановки реакции обратной транскрипции и ПЦР.
6.2. Описание методики выделения РНК из суспензий внутренних органов мелких млекопитающих. Для экстракции РНК из легочных суспензий используют двухэтапную экстракцию РНК. На первом этапе: в пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками вносят по 400 мкл лизирующего раствора (в состав которого входят: гуанидинтиоцианат - 25%; цитрат натрия - 0,12 мМ (рН = 7,0); саркозил натрия - 0,26%; кислый фенол - 44% и меркаптоэтанол - 0,35%). В пробирки с лизирующим буфером добавляют по 150 мкл образца, используя наконечник с аэрозольным барьером. Плотно закрывают крышки и перемешивают на вортексе. Далее к лизированным образцам добавляют 30 мкл ацетата натрия - 0,1 М (рН = 4,0), перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 с при 10 тыс. об./мин. В эти же пробирки добавляют 300 мкл буфера (кислый фенол), перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 с при 10 тыс. об./мин. Далее вносят в пробирки по 100 мкл хлороформа, встряхивают на вортексе в течение 1 мин. и помещают в холодильник при 2 - 8 °C на 10 мин. Затем центрифугируют пробирки в течение 10 мин. при 12 - 14 тыс. об./мин.
Для проведения второго этапа экстракции осторожно вынимают пробирки из центрифуги и, не задевая промежуточной фазы, переносят 450 мкл водной фазы в пробирку, содержащую 450 мкл лизирующего буфера и 30 мкл сорбента, и последовательно повторяют все процедуры экстракции РНК, описанные выше в п. 6.1 (методика выделения РНК из плазмы крови).
6.3. Описание методики проведения обратной транскрипции для получения кДНК. Обратную транскрипцию проводят со случайными праймерами. Готовится общая реакционная смесь из расчета количества анализируемых образцов. Для этого в пробирку с 0,02 М дитиотрейтолом (ДТТ) добавляют 125 мкл реакционной смеси, содержащей: дезоксинуклеозидтрифосфаты - дНТФ в концентрации 0,002 М; трис-(оксиметил)-аминометан-гидрохлорид (трис-HCl) - 0,1 М; калия хлорид - 0,15 М; магния хлорид - 0,006 М; случайные праймеры - 3 ОЕ/мл. К полученному раствору добавляют 6 мкл ревертазы (MMLV) в концентрации 200 Ед./мкл и все реагенты аккуратно перемешивают на вортексе 1 - 2 с. Реакция проводится в реакционном буфере в объеме 60 мкл (с учетом 30 мкл пробы). Для этого в каждую пробирку вносят по 30 мкл готовой реакционной смеси и добавляют 30 мкл РНК-пробы, затем все осторожно перемешивают и помещают в термостат при 37 °C на 30 мин. В результате реакции обратной транскрипции получают кДНК, которую используют для последующей постановки ПЦР.
6.4. Описание методики проведения ПЦР. Реакция проводится в растворе следующего состава: смесь дНТФ в концентрации 1 мМ; фермент ДНК-полимераза "ДиаТак" - 0,1 ед./мкл, трис-HCl - 0,17 М; аммония сульфат - 42 мМ; магния сульфат - 7,5 мМ; бычий сывороточный альбумин - 0,25 г/л; Tween-20 - 0,025%; глицерин - 20%; ксиленцианол - 0,02% и смесь из двух праймеров Hant S/F - Hant S/R или Hant M/F - Hant M/R (Прилож. 4), каждый в концентрации 3 пмоль/мкл.