Реакция проводится в реакционном буфере в объеме 25 мкл (с учетом 10 мкл кДНК) при использовании режима "горячего старта". При этом реакционная смесь (нижняя), содержащая праймеры и дезоксинуклеозидтрифосфаты, должна быть отделена слоем воска от верхней реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер и фермент. Расплавление воска и перемешивание смесей происходит только после запуска программы, что улучшает качество анализа в целом.
ПЦР проводят на амплификаторах с применением активного режима термоциклирования. Оптимальные температурно-временные параметры на приборе (типа "Терцик") следующие: денатурация 95 °C в течение 5 мин., затем 95 °C - 10 с, 62 °C - 10 с, 72 °C - 10 с - 2 цикла; 95 °C - 10 с, 60 °C - 10 с, 72 °C - 10 с - 2 цикла; 95 °C - 10 с, 58 °C - 15 с, 72 °C - 15 с - 38 циклов, заключительная элонгация 72 °C - 3 мин.
6.5. Описание методики учета результатов ПЦР методом электрофореза.
Продукты амплификации, полученные в ПЦР, анализируют методом
горизонтального электрофореза в агарозном геле и 1 х ТБЕ (трисборатном)
буфере. Готовят рабочий электрофорезный ТБЕ-буфер, состоящий из: трис-HCl -
0,9 М; Na -ЭДТА - 0,02 М; борной кислоты - 0,9 М; этидия бромида - 20
2
мкг/мл. В стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл помещают 1,8
г агарозы, добавляют 100 мл рабочего буфера и нагревают до полного
растворения агарозы. Затем расплавленный гель охлаждают до 65 - 70 °C и
заливают в подготовленную заранее форму камеры с гребенкой (толщина геля
около 0,6 см). Для анализа ПЦР-продукта используют 10 - 15 мкл пробы,
которую вносят в лунки геля. Продолжительность электрофореза составляет 18
- 20 мин. После проведения электрофореза гель переносят на трансиллюминатор
и фотографируют с помощью видеосистемы (типа "Gel Doc 2000"). Длина
специфических амплифицированных фрагментов кДНК при использовании
универсальных праймеров Hant S/F - Hant S/R (Прилож. 4) составляет для
вируса Пуумала 475 п.н., для вируса Тула - 466 п.н., для вирусов Добрава,
Сеул, Хантаан - 463 п.н.; при использовании универсальных праймеров Hant
M/F - Hant M/R (Прилож. 4) длина специфически амплифицированного фрагмента
для всех вирусов комплекса ГЛПС составляет 327 п.н.
6.6. Подтверждающее тестирование образцов на ГЛПС и генотипирование хантавирусов осуществляется в Референс-центре на базе ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (Прилож. 1). Для этого необходимо собрать материал от грызунов и больных людей, как указано в п. п. 4.2 - 4.3. Собранный материал должен быть предварительно протестирован с помощью одной из сертифицированных тест-систем, перечисленных в Прилож. 2. Протестированный материал, упакованный согласно п. 4.4, направляется в Референс-центр по указанному адресу (Прилож. 1).
7. Генотипирование хантавирусов и интерпретация
полученных результатов
Известно, что метод секвенирования считается "золотым стандартом" для типирования вирусов. Учитывая высокое разнообразие и недостаточную изученность спектра хантавирусов, циркулирующих на территории России, является целесообразным проведение секвенирования кДНК хантавирусов.
Пробы с высокой вирусной нагрузкой, полученные в результате ПЦР с
обратной транскрипцией, могут быть секвенированы на базе лаборатории,
оснащенной необходимым оборудованием. После визуального учета на
электрофорезе качества полученных ампликонов оставшуюся часть пробы (15 -
20 мкл) подвергают очистке. Для этого амплификат переносят в пробирку
объемом 1,5 мл, смешивают с равным объемом смеси фенол - хлороформ (1:1) и
перемешивают до образования эмульсии. Для разделения водной и органической
фаз образцы центрифугируют на настольной центрифуге в течение 15 - 30 с при
12000 об./мин. Затем верхний (водный) слой переносят в новую пробирку,
добавляют повторно равный объем смеси фенол - хлороформ (1:1), перемешивают
и центрифугируют в том же режиме. После этого отбирают водную фазу,
добавляют одну десятую объема 3 М натрия ацетата и тщательно перемешивают.
Добавляют два объема охлажденного во льду 96%-ного этанола, перемешивают и
охлаждают 10 мин. при 0 °C. После центрифугирования (в режиме - 10 мин. при
12000 об./мин.) удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок промывают
70%-ным этанолом, подсушивают и растворяют в 50 мкл буфера (трис-HCl 0,01
М; Na -ЭДТА - 0,001 М). После очистки проб проводят их секвенирование,
2
используя для этого капиллярный автоматический секвенатор (типа "ABI-3100
PRISM") и соответствующий ему набор реактивов. В качестве инициирующих
олигонуклеотидов для секвенирования используют универсальные праймеры
(Прилож. 4), с помощью которых были получены амплифицированные в ПЦР
фрагменты ДНК. Полученные последовательности нуклеотидов анализируют с
помощью программы "MEGA". Нуклеотидные последовательности новых
РНК-изолятов сравнивают с полными нуклеотидными последовательностями S- и
(или) М-сегментов штаммов хантавирусов, зарегистрированных в международной
базе данных "GenBank", или ранее выявленными изолятами, нуклеотидные
последовательности которых лежат в области, ограниченной универсальными
праймерами (Прилож. 4). Для сравнения рекомендуется использовать
РНК-изоляты (фрагменты М- и S-сегментов) хантавирусов Добрава, Пуумала и
Тула, выявленные на территории России в 2003 - 2008 гг., имеющие следующие
номера в "GenBank": DQH64647-64671; DQH64673-64687; DQ061259;
DQ061265-DQ061269; EU549802-549815; EU562892-563018; EU652421-EU652443.
Использование для амплификации и секвенирования хантавирусов рекомендуемых универсальных праймеров имеет ряд преимуществ:
- позволяет пополнить уже имеющуюся информационную базу данных, включающую более 200 РНК-изолятов хантавирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации;
- значительно упрощает и ускоряет процедуру секвенирования (за счет возможности использования коротких фрагментов генома для сравнения);
- позволяет интерпретировать полученные результаты, т.е. определять географическую принадлежность новых РНК-изолятов, оценивать степень гетерогенности существующих в природе популяций, выявлять уровень сходства и различий "новых" от ранее выявленных штаммов.
Информация, полученная в результате генотипирования хантавирусов, является эпидемиологически значимой, может представлять особую важность при определении эпидемического потенциала природных очагов ГЛПС и оценке уровня опасности "новых" штаммов для человека.
Унификация методических подходов для проведения молекулярно-генетических исследований предоставляет возможность создания единой информационной базы данных, позволяющей анализировать, интерпретировать и сопоставлять новую информацию с ранее полученными результатами.
Список сокращений
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ДОБ - вирус Добрава
ПУУ - вирус Пуумала
ИФА - иммуноферментный анализ
МФА - метод иммунофлуоресценции
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
кДНК - комплементарная ДНК
ООИ - особо опасные инфекции
н.п. - нуклеотидная последовательность
п.н. - пара нуклеотидов
Приложение 1
КООРДИНАТЫ РЕФЕРЕНС-ЦЕНТРА, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩЕГО ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ
ПОДТВЕРЖДАЮЩЕЕ ТЕСТИРОВАНИЕ И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
КОМПЛЕКСА ГЛПС
1. Референс-центр по мониторингу за полиомиелитом, ГЛПС, клещевым вирусным энцефалитом на базе ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.
142782, Московская обл., Ленинский р-н, пос. Институт полиомиелита. Тел.: (495)439-90-94. Факс: (495)439-93-21. E-mail: centrglps@gmail.ru, evgeniytkach@mtu-net.ru
Приложение 2
ПЕРЕЧЕНЬ
СЕРТИФИЦИРОВАННЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ
ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ДИАГНОЗА ГЛПС У БОЛЬНЫХ ЛЮДЕЙ И ПРОВЕДЕНИЯ
СКРИНИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА НАЛИЧИЕ ХАНТАВИРУСНОГО АНТИГЕНА
У НОСИТЕЛЕЙ ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
"Культуральный поливалентный диагностикум ГЛПС для непрямого МФА" - для выявления специфичных антител в сыворотках крови больных людей (производства ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН)
"Иммуноферментная тест-система (Хантагност)" - для выявления хантавирусного антигена (производства ГУ ИПиВЭ им. М.П. Чумакова РАМН)
Приложение 3
ПЕРЕЧЕНЬ
НАБОРОВ РЕАКТИВОВ, РЕКОМЕНДУЕМЫХ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА НА ГЛПС
Для проведения молекулярно-генетических исследований биологического материала на ГЛПС возможно использование любых сертифицированных наборов реактивов, предназначенных для выделения РНК, постановки ПЦР, обратной транскрипции и электрофореза.
Пример комплектации сертифицированных наборов реагентов (производства ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора"), необходимых для проведения ПЦР-исследований на хантавирусы:
- "РИБО-сорб" - комплект реагентов, предназначенный для выделения РНК/ДНК из клинического материала методом аффинной сорбции на частицах силикагеля;
- "РИБО-золь-В" - для выделения РНК из клинического материала (лейкоцитов крови, суспензий клеток, гомогенизированных биоптатов) методом гуанидин-фенол-хлороформовой экстракции;
- "Реверта" - комплект реагентов, предназначенный для получения кДНК на матрице РНК;
- "ЭФ-200" - комплект реагентов, предназначенный для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Тест-система "АмплиСенс(R) Хантавир" (производства ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора"), предназначенная для выявления РНК хантавирусов комплекса ГЛПС в полевом и в клиническом материале методом ПЦР, так же, как и другие ПЦР тест-системы, доступные для потребителя, но не имеющие сертификата и государственной регистрации, могут быть использованы только для научных целей.
Приложение 4
НАБОРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ
В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ
ГЕНОТИПОВ ХАНТАВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Наименование | Нуклеотидная последовательность 5' - 3' | Позиция генома | Штамм, сегмент |
| Универсальные праймеры для детекции вирусов комплекса ГЛПС | |||
| Hant M/F | ATC(T/A)ATAGAIGGTGCATGGIGTTCTG | 2971-2996 | Dobrava, SK/Aa AY961616, М-сегмент |
| Hant M/R | CCACATT1AGGTGCICCATCATC | 3297-3275 | |
| Hant S/F | TT(C/T)AA(G/A)GATGACA(C/G)CTCATT TGAGGAT | 475-501 | Puumala, CG17/Baskiria- 2001 AF442613, S-сегмент |
| Hant S/R | C(T/A)GGTGC(A/C)CA(A/G)GCAAA(T/G) ACCCA | 949-928 | |