Смекни!
smekni.com

«Санкт-Петербургский нии эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» (стр. 10 из 12)

Схема проведения бактериологического исследования включает «обогащение» исследуемого материала при низкой температуре, использование дифференциально-диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их биотипа, серотипа, вирулентности.

Несмотря на низкую эффективность, прямой посев нативного материала на плотные питательные среды проводят, как правило, при подозрении на инфицированность иерсиниями продуктов питания и/или при групповых заболеваниях, вызванных употреблением (инфицированных) продуктов. Для этой цели эффективнее применение дифференциально-диагностическая среда для выделения иерсиний с бромтимоловым синим (СБТС).

При проведении «холодового обогащения» исследуемый материал в пептонно-калиевой среде (ПК) помещают в холодильник и выдерживают в нем до первого положительного посева, но не более 10 дней.

Высев на плотные питательные среды проводят со среды ПК на 2-3, 5-7 и 10 сутки. Высевы производят петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. При использовании среды Эндо и/или исследовании загрязненных проб, особенно при массовом поступлении, для ингибирования роста посторонней флоры, проводят щелочную обработку. Методика щелочной обработки основана на относительной резистентности иерсиний к щелочи по сравнению с другими микроорганизмами.

Методика щелочной обработки

Щелочная обработка проб проводится перед каждым высевом со среды ПК на плотную питательную среду. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 0,2 мл свежеприготовленного 0,72 % раствора КОН в 0,5 % растворе NaCl и 0,2 мл исследуемого материала, перемешивают, выдерживают 1-1,5 минуты и высевают на СБТС или среду Эндо. Посевы инкубируют при (26±2) оС.

Просмотр выросших колоний проводят, как правило, через 48 ч, учитывая их морфологию (таблица 5).

Биохимическая идентификация

Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают на основании комплекса типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

Для предварительного отбора используют стабильный биохимический признак – наличие уреазы. Положительный уреазный тест позволяет отличить иерсиний от других видов патогенных кишечных бактерий – шигелл, сальмонелл, эшерихий и др. Отсев подозрительных колоний проводят на скошенный столбик среды Олькеницкого штрихом и уколом в столбик. Как и иерсинии, бактерии рода Proteus гидролизуют мочевину, но они, в отличие от Yersinia, всегда расщепляют триптофан.

Ферментативная активность исследуется обычным способом на средах Гисса при 28 оС; подвижность в 0,3 % полужидком агаре и реакция Фогес-Проскауэра (среда Кларка) – при 25 и 37 оС.

Таблица 4

Материал для исследования и его подготовка

Вид исследуемого материала

Кол-во, сроки

Правила взятия, подготовка к исследованию бактериологическим методом и методом ИФА

Правила взятия, подготовка к исследованию в ПЦР

Материал от больных
Испражнения* 0,5-1,0 г на протяжении всего периода заболевания Стерильной деревянной палочкой из судна; ректальным зондом. Поместить в 5,0 мл среды накопления (ПК). В одноразовый контейнер с 5-10 мл забуференного физ. р-ра (ЗФР) рН 7,2-7,4, ложечкой, прилагаемой к контейнеру
Моча* 20-30 мл средней порции утренней мочи в первые 7 дней болезни Засевается осадок после центрифугирования или отстаивания; для ИФА осадок исследовать нативно, затем поместить в 5,0 мл среды накопления В одноразовый контейнер
Смыв из зева В первые 3 дня болезни Натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченным в физ. р-ре. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Кровь 5-10 мл в первые 3 дня болезни Стерильно из локтевой вены; сгусток измельчить, поместить 1 мл в 5,0 мл среды накопления В одноразовую пробирку
Операционный или секционный материал
Аппендикулярные отростки 1,0-2,0 г Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Мезентериальные лимфоузлы, др. органы и ткани 1,0-2,0 г Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Желчь 1,0-2,0 мл Собрать в пробирку 0,5-1,0 мл, поместить в 5,0 мл среды накопления
Содержимое кишечника 0,5-1,0 г Собрать в пробирку 0,5-1,0 мл, поместить в 5,0 мл среды накопления В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Сгусток крови 0,5-1,0 мл Стерильно измельчить, 1 мл поместить в 5,0 мл среды накопления В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР

* - высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3-5 дней болезни и до назначения антибиотиков


Вид исследуемого материала

Кол-во, сроки

Правила взятия, подготовка к исследованию бактериологическим методом и методом ИФА

Правила взятия, подготовка к исследованию в ПЦР

Материал от животных и птиц
Помет 0,5-1,0 г Стерильной деревянной палочкой. Поместить в 5,0 мл среды накопления. В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Тонкий кишечник 1,0-2,0 г Забирают стерильно участок в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым. Поместить в 5,0 мл среды накопления. В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Брыжейка, мезентериальные лимфоузлы 1,0-2,0 г Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР

Материал из внешней среды

Пищевые продукты[1] 25 г Измельчить, поместить в среду накопления в соотношении 1:10, для посева использовать надосадочную жидкость. В одноразовый контейнер ложечкой, прилагаемой к контейнеру
Овощи 10 штук каждого вида Смыв одним влажным стерильным тампоном с поверхностей на границе здоровой и загнивающей части. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Смывы с оборудования, инвентаря, тары 10 одноименных поверхностей Одним влажным стерильным тампоном с поверхностей площадью 1002 см каждая. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Гнезда грызунов Примерно 10 г субстрата гнезд Образец растереть в ступке с песком и фосфатно-буферным р-ром. 1,5 мл взвеси внести в 5 мл среды накопления 1,5 мл взвеси в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР
Вода из емкостей для хранения, вода открытых водоемов Профильтровать через 0,22 мкм бумажный фильтр 1-2 л воды Фильтры поместить в среду накопления. Фильтры поместить в одноразовые контейнеры с 5 мл ЗФР
Почва 50-100 г Помещают в среду накопления в соотношении 1:10, для посева использовать надосадочную жидкость. В одноразовый контейнер ложечкой, прилагаемой к контейнеру с 5 мл ЗФР

Таблица 5

Характеристика колоний иерсиний на плотных питательных средах

Вид

Среда Эндо

Среда Хоттингера

СБТС

Примечание

24 часа

48 часов

24 часа

48 часов

24 часа

48 часов

Yersinia pseudotuberculosis Колонии мелкие (росинчатые) круглые, выпуклые, блестящие, бесцветные Колонии диаметром 0,1-0,2 мм, крупные, выпуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные Колонии диаметром 0,1-0,2 мм, голубовато-белые полупрозрачные с ровными краями, слизистые со слабоприподнятым центром (под микроскопом имеют вид пирамид или со сходящимися к центру гранями) Колонии диаметром 0,2-0,5 мм, прозрачные с ровным краем. В полиморфной популяции – часть колоний бугристая с неровными фестончатыми краями Колонии мелкие круглые, могут иметь слегка желтоватую окраску Колонии диаметром 1 – 2 мм, голубовато-зеленоватые, с фестончатыми краями, выпуклые с приподнятым центром и суховатой матовой поверхностью на синем фоне среды На СБТС через 48 ч колонии E. сoli – ярко-желтые, диаметром 2-3 мм, сочные, выпуклые; Sh. flexneri – желтые, диаметром 1-2 мм сочные, плоские
Yersinia enterocolitica Такие же Такие же, но с розоватым оттенком Колонии диаметром 0,1-0,2 мм до 0,5 мм, круглые, выпуклые с ровным краем, полупрозрачные с голубоватым оттенком мягкой консистенции Колонии диаметром 0,3-0,5 мм более выпуклые, с ровным краем, прозрачные Колонии диаметром 2 – 4 мм, голубовато-зеленоватые, выпуклые, сухие, с матовым налетом

Y. pseudotuberculosis отличаются от Y. enterocolitica по отношению к сахарозе и рамнозе.

Тесты расширенного биохимического ряда - ферментация ксилозы, сорбита, салицина и образование индола – позволяют определить биотип Y. enterocolitica.