«Санкт-Петербургский нии эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» (стр. 12 из 12)
| 2 этап (3-и сутки) холодовое обогащение |  | щелочная обработка |  |  подготовка проб для ПЦР | Проведение ПЦР, получение результата на 3-и сутки после поступления материала |
бактериологический
высев
3 этап
(5-е сутки). Учет результатов
бактериологического
исследования, выделение
и идентификация культур.
Двукратно ПЦР – отрицательные анализы позволяют прекращать дальнейшее бактериологическое исследование.
6. Серологические методы
Общие правила постановки серологических реакций
Антитела к возбудителям псевдотуберкулеза и иерсиниоза появляются в крови уже на первой недели болезни, а существенное повышение их уровней происходит к началу_3-й недели. Этими сроками регламентировано обязательное исследование парных сывороток крови. Через 2 месяца часто наблюдается снижение концентрации антител, а через 6 месяцев они могут обнаруживаться в минимальных значениях (1:50; 1:100).
Наиболее выраженная динамика антителообразования наблюдается у больных с заболеванием средней тяжести. При легком течении, особенно при абдоминальной форме, динамика антител выражена слабо, титры антител начинают регистрироваться в диагностических значениях не ранее второй недели заболевания.
В связи с наличием у иерсиний перекрестно реагирующих антител предложен учет минимального диагностического титра в РА и РНГА, равный 1:160 и 1:200, соответственно. Достоверным считается 2-4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.
Реакция агглютинации (РА)
Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10 млрд взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0,9 % растворе хлорида натрия. Перед постановкой антигены разводят 1:10 (рабочая концентрация 1 млрд). Реакцию ставят методом равных объемов. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
Реакция непрямой гамагглютинации (РНГА)
Для постановки РНГА используют стандартные эритроцитарные диагностикумы к Y. pseudotuberculosis I серотипа и Y. enterocolitica серотипов О:3 и О:9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов.
В связи с тем, что срок годности эритроцитарных диагностикумов составляет 3 года, необходима периодическая (не реже 1 раза в квартал) проверка их активности. Ее проводят с контрольной псевдотуберкулезной сывороткой с известным титром иерсиниозных антител. Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 3 разведения ниже, чем они в ней содержатся, то такой препарат не пригоден для дальнейшего использования.
Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Для постановки ИФА используют тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgG», предназначенные для выявления антител классов A, M и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Высокая чувствительность и специфичность метода достигается благодаря использованию в качестве антигенов, сорбированных на поверхности стрипов, нескольких рекомбинантных белков наружной мембраны иерсиний. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
Приложение 3
Среды, используемые для первичного выделения культур
Жидкие среды накопления:
Пептонно-калиевая среда (ПК[2])
Состав среды: пептон ферментативный – 10,0 г
двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4) – 1,0 г
Способ приготовления: компоненты вносят в 1,0 л дистиллированной воды, кипятят, помешивая, 2-3 мин, доводят рН до 7,6-7,8. Среду стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. 20 мин. Хранят при 4-7 0С в течение 7-10 дней.
Среда для подавления роста посторонней микрофлоры:
Готовят растворы: 40 % КОН (40 г КОН на 100 мл дистиллированной воды)
0,5 % NaCl (0,5 г NaCl на 100 мл дистиллированной воды)
Растворы стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. 30 мин, хранят при 4-7 0С.
Рабочую концентрацию среды готовят, смешивая 10,0 мл 0,5 % раствора NaCl и 0,18 мл 40 % раствора KOH. Среда не подлежит хранению.
Плотные питательные среды:
Дифференциально-диагностическая среда для выделения иерсиний (СБТС[3]),
рН 7,8.
Состав среды: питательный агар для культивирования микроорганизмов – 35,0 г
желчь очищенная – 6,0 г
глюкоза – 10, 0 г
мочевина – 5,0 г
бромтимоловый синий воднорастворимый – 0,128 г
двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4) – 1,0 г
Способ приготовления: компоненты вносят в 1,0 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 5 мин на медленном огне. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вновь кипятят 1-2 мин, охлаждают до 45-50 0С и разливают в чашки Петри. Хранят среду в течение 7-10 дней при 4-7 0С.
Приложение 4
Среды, используемые для идентификации вирулентных иерсиний
Среда Кларка для определения аутоагглютинации:
Состав среды: двузамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4) – 5 г
пептон – 7 г
глюкоза – 5 г
вода – до 1 л
Способ приготовления: пептон и фосфат растворяют в воде и кипятят 2-5 мин. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием при 1 атм. в течение 20 мин, асептично добавляют стерильный раствор глюкозы и разливают по 3-5 мл в пробирки.
Среда для определения кальцийзависимости (кальцийдефицитный агар):
Готовят растворы: 0,25 М щавелевокислого натрия (33,5 г на 1 л дистиллированной воды)
0,5 М хлорида магния (101,5 г на 1 л дистиллированной воды)
Растворы стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. 30 мин, хранят при 4-7 0С.
В качестве питательной основы используют среду АГВ. В 100 мл расплавленной среды (около 50 0С) асептично вносят 8 мл 0,25 М раствора щавелевокислого натрия тщательно перемешивают; добавляют 4 мл 0,5 М раствора хлорида магния (указанная последовательность внесения солей обязательна). После перемешивания готовую среду разливают по 15-20 мл в чашки Петри. Хранят среду в течение 7-10 дней при 4-7 0С.
Приложение 5
2. Нормативные и методические документы
1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999г. № 52 – ФЗ.
2. Постановление Правительства Российской федерации от 24 июня 2000г. № 554 «Об утверждении положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании».
3. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных 11. Иерсиниозы. Санитарные правила СП. 3.1.094-96. Ветеринарные правила 13.3.1318-96.
4. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности и гельминтов».
5. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.5.3.1129-02 «Санитарно-эпидемиологические требования к проведению дератизации».
6. Методические указания МУ 1.3.1888-04. «организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III и IV групп патогенности.
7. Методические указания МУ 3.5.5.1034-01. «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР».
[1] Кол-во указано в соответствии с требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
[2] Состав среды защищен патентом
[3] Состав среды защищен патентом. Аналог выпускает ГосНИИ прикладной микробиологии (пос. Оболенск, Московская обл.)