6.6. Исследование туберкулоцидной эффективности камерного метода обеззараживания
Камерный метод используют для обеззараживания одежды, обуви, постельных принадлежностей, мягких игрушек и др.
В качестве тест-микроорганизма используют Mycobacterium В5 в виде суспензии, содержащей 2∙109 КОЕ в 1 мл, которой контаминируют тест-объекты из батиста, бязи и других материалов, соответствующих обеззараживаемым объектам. Тест-объекты закладывают в стерильные конверты из хлопчатобумажной ткани (по 2 тест-объекта в конверт). Пронумерованные тест-объекты помещают в хлопчатобумажные мешочки с максимальными термометрами и размещают в толще объектов в контрольные точки камеры на трех уровнях.
После обеззараживания мешочки извлекают из камеры и записывают показания максимальных термометров. Тест-объекты помещают в пробирки с 5 мл картофельно-глицеринового бульона.
Инкубирование посевов с тест-объектами проводят при температуре (37±1)0С в течение 10-21 суток. Отсутствие помутнения питательной среды указывает на гибель микобактерий в тест-объектах. При наличии роста проводят сравнение выделенной культуры с тест-микобактерией.
В качестве контроля используют тест-объекты, которые не помещали в камеру, и питательную среду, которую применяли для культивирования тест-микроорганизма после обработки. Контрольные тест-объекты и среду проверяют аналогично тест-объектам, которые обрабатывали в камере. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки.
Эффективность обеззараживания вещей в дезинфекционных камерах должна быть равна 100 % гибели Mycobacterium В5 на использованных тест-объектах.
6.7. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС
при обеззараживании рук в резиновых перчатках
В качестве тест-микроорганизма используют суспензию M. terrae, содержащую (1,0-5,0)∙108 КОЕ/мл, которую разводят до содержания 107, 105 и 103 КОЕ/мл.
Для устранения посторонней микрофлоры руки, включая запястья и предплечья, испытатели тщательно моют с мылом в теплой проточной воде, затем протирают стерильной марлевой салфеткой и надевают резиновые перчатки.
Поверхность резиновых перчаток, надетых на руки испытателей-добровольцев, контаминируют путем тщательного растирания 1 мл суспензии тремя вышеуказанными разведениями (каждое разведение на одного испытателя). После подсыхания микробной взвеси для контроля исходной обсемененности с поверхности резиновой перчатки тыльной стороны кисти делают смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5×5 см, смоченной стерильной питьевой водой. Затем салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами и встряхивают 10 мин. Полученный смыв высевают по 0,5 мл на скошенную поверхность питательной среды в пробирке.
Для обеззараживания поверхности перчаток в сжатую ладонь руки в печатке испытателю-добровольцу наносят 2,5 мл исследуемого ДС. Затем он в течение 10-15 сек протирает этой порцией дезинфицирующего раствора поверхность перчаток обеих рук, совершая движения рук, которые выполняют при обработке кожи рук антисептиком. После этого такую же операцию проводят, нанося 2,5 мл дезинфицирующего раствора на ладонь второй руки и засекают по секундомеру начало экспозиции.
После 5-мин экспозиции делают смыв марлевой салфеткой (5×5 см), смоченной соответствующим нейтрализатором, предварительно проверенным на эффективность нейтрализации и статического действия. Салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильного нейтрализатора на 10 мин. Затем салфетку переносят стерильным пинцетом в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами, встряхивают пробирку 10 мин в шейкере. Из полученного смыва делают посев по 0,5 мл на твердые питательные среды в пробирках (не менее 3 пробирок на пробу).
Эффективными считают режим применения ДС, обеспечивающий 100% гибель тест-микроорганизма на резиновых перчатках, защищающих кожу рук.
6.8. Исследование туберкулоцидной эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания выделений (моча, кал, мокрота) и крови
Обеззараживание мочи. Мочу разливают в колбы или пробирки по 8 мл, добавляют 1 мл суспензии, содержащей 2∙109 КОЕ/мл M. terrae, и 1 мл инактивированной лошадиной сыворотки.
Растворы испытываемого ДС готовят в концентрациях, обеспечивающих туберкулоцидный эффект при испытании его на батистовых тест-объектах с белковой защитой.
Испытуемые растворы ДС добавляют к моче в равном или двойном объеме. Отмечают время контакта и через интервалы 15, 30, 60 мин смесь в количестве 1 мл пипеткой переносят в пробирки с 5 мл соответствующего нейтрализатора. После тщательного смешивания 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку с 5 мл нейтрализатора и затем засевают по 0,1 мл в пробирки на скошенную поверхность питательной среды, как из первой, так и из второй пробирки. Посевы инкубируют в термостате при (37±1) 0С.
Контролем служат аналогично поставленные опыты только с добавлением к моче не дезинфицирующего раствора, а воды.
Ориентировочный учет результатов проводят через 10-14 суток, окончательный – 21 сутки. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100 %. Окончательное заключение об эффективности ДС делают на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами.
Эффективным считают средство и режим его применения, обеспечивающие 100 % гибель тест-микроорганизмов.
Обеззараживание кала. При разработке режимов обеззараживания кала учитывают соотношение ДС к обеззараживаемой массе, время обработки, температуру, консистенцию обеззараживаемых выделений, степень гомогенизации в процессе обеззараживания.
Исследования проводят в два этапа. На первом этапе в качестве тест-объекта используют 20% эмульсию фекалий, на втором - оформленные фекалии.
Для приготовления 20% эмульсии 20 г кала растирают в ступке и добавляют 80 мл воды; полученную эмульсию фильтруют через двойной слой марли, стерилизуют в автоклаве, разливают пипеткой в пробирки по 9 мл и добавляют по 1 мл 2∙109 КОЕ/мл в суспензии M. terrae. Опыты начинают ставить с концентрации, вызывающей гибель тест-микроорганизма в моче с белком через 30 минут. Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным или двойным объемом дезинфицирующего раствора и через определенные интервалы времени производят высевы так же, как и при обеззараживании мочи. Результаты учитывают через 21 сутки.
При положительных результатах проводят опыты с большим количеством оформленных фекалий (200-250 г). Для этого помещают их в сосуд, заливают дезинфицирующим раствором или засыпают сухими ДС в равном или двойном количестве по отношению к весу фекалий, определяют происходит ли гомогенизация фекалий. Затем небольшую часть каловых масс размешивают стеклянной палочкой с жидкостью, а остальную массу оставляют в виде небольших комочков. Через определенные промежутки времени (например, 30, 60 мин) проводят посев.
Посев жидкой части фекалий производят так же, как в опытах с мочой. Плотные же части (комочки) забирают бактериологической петлей и помещают в 5 мл соответствующего нейтрализатора, растерев их о края пробирки и тщательно перемешав. Затем стерильной пипеткой переносят из этой пробирки 1 мл смеси во вторую пробирку, тоже содержащую нейтрализатор. Как из первой, так и из второй пробирки производят посев по 0,1 мл на скошенную поверхность питательной среды в пробирках (не менее чем в три пробирки). Окончательный результат учитывают через 21 сутки, а предварительный - через 10-14 суток.
Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением вместо дезинфицирующего раствора воды. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100%. Судят об эффективности исследуемого средства на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами. Эффективным считают средство и режим его применения, обеспечивающие 100 % гибель тест-микроорганизмов в обеззараживаемом материале.
Обеззараживание крови и мокроты. В качестве тест-объектов при оценке туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания крови, используют кровь, а мокроты - куриный белок. Для контаминации тест-объектов тест-микроорганизмом к 9 мл 40 % крови или 50 % куриного белка добавляют по 1 мл суспензии тест-микроорганизма, содержащей 2∙109 КОЕ/мл, перемешивают и разливают по 1 мл в стерильные флаконы. Затем во флаконы засыпают или наливают исследуемое ДС в объемных (5 %, 10 % и т.д.) соотношениях к исследуемому материалу. Через определенные промежутки времени (1 час, 2 часа и т.д.) с помощью стерильной бактериологической петли производят отбор пробы смеси и переносят ее в 5 мл нейтрализатора для нейтрализации остаточного действия ДС на тест-микроорганизм. По истечении 5 мин из этой пробирки с помощью пипетки производят высев по 0,2 мл исследуемой пробы на скошенную поверхность питательной среды в пробирках. Пробирки с посевами инкубируют при (37±1) 0С.
Предварительный результат роста тест-микроорганизмов на чашках учитывают через 10-14 суток, а окончательный – через 21 сутки.
Эффективным считают средство, обеспечивающее 100 % гибель M. terrae в обеззараживаемом материале.
6.9. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания медицинских отходов
При изучении туберкулоцидной активности ДС с целью разработки режимов обеззараживания медицинских отходов используют тест-объекты из резин, пластмасс, текстильных материалов, стекла, металлов. Для приготовления тест-объектов стерильные одноразовые изделия медицинского назначения (бинты, ватные тампоны, фрагменты систем для переливания крови и лекарственных препаратов, катетеры, шпатели, шприцы, иглы перчатки, одноразовое белье, салфетки, пипетки, трубки и пр.) измельчают и погружают в суспензию тест-микроорганизма, содержащую 2∙109 КОЕ/мл с добавлением 40 % инактивированной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота. После достаточного пропитывания объекты извлекают в сухую стерильную емкость и подсушивают в термостате при 370С в течение 20 мин или при комнатной температуре 18-200С и относительной влажности воздуха 50-60 % в течение 1 ч.