Контаминированные тест-объекты погружают в емкость с испытуемым дезинфицирующим раствором так, чтобы он полностью закрывал их. Контроль эффективности обеззараживания объектов проводят через каждые 15-30 мин в течение времени до 360 мин. Для этого тесты из различных материалов (по два каждого наименования) извлекают из дезинфицирующего раствора, промывают в растворе соответствующего нейтрализатора, из полученных смывов производят посев по 0,1 мл на поверхность твердой питательной среды. Контрольные тест-объекты погружают в стерильную водопроводную воду на срок максимальной экспозиции, а затем высевают на скошенную поверхность питательной среды. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре (37±1)0С. Окончательный учет результатов проводят на 21 сутки.
Критерий эффективности обеззараживания медицинских отходов – 100 % гибель M. terrae на тест-объектах, обработанных ДС.
6.10.Методы определения туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств при обеззараживании воздуха
Химические ДС применяют для обеззараживания воздуха в помещениях в виде аэрозолей или паров растворов ДС, а также газов.
При исследовании эффективности обеззараживания воздуха химическими ДС с целью разработки режима его применения при туберкулезе в качестве тест-микроорганизмов используют M.terrae.
Исследования проводят в испытательных камерах объемом 1 или 2 м3. Предварительно внутреннюю поверхность камеры моют раствором моющего средства, остатки которого затем смывают водопроводной водой и включают бактерицидный УФ-облучатель. В центре камеры располагают продезинфицированный вентилятор, производительностью 15-25 м3/час, назначение которого - предотвращение быстрого оседания микроорганизмов.
Для определения эффективности обеззараживания воздуха используют аспирационный метод.
В камере распыляют суспензию тест-микроорганизма в количестве, достаточном для создания в воздухе камеры концентрации микроорганизмов 2,1х104 КОЕ/м3 (определяется опытным путем).
Аэрозоль дезинфицирующего средства создают с помощью распыливающей аппаратуры, которая обеспечивает образование в воздухе не менее 80% частиц с дисперсностью 10-15 мкм, и включают вентилятор. Затем в камере распыляют раствор исследуемого средства и через определенные промежутки времени проверяют обсемененность воздуха.
Аспирационный метод основан на аспирации воздуха через жидкость. При использовании аспирационного метода для оценки эффективности обеззараживания воздуха необходимо следующее оборудование:
-воздуходувка с производительностью 15-25л/мин;
-стерильные склянки Дрекселя с 50 мл стерильной водопроводной воды из расчета 2 шт. на 1 пробу. Предварительно в стерильную воду вносят нейтрализатор, соответствующий испытуемому ДС.
-трубка диаметром 8-10 мм, длиной 50-60 см, которая вводится в камеру для забора проб воздуха в центре камеры;
-стерильные резиновые шланги, соединяющие склянки Дрекселя (последовательно одну за другой) и далее с воздуходувкой.
Подготовка камеры к эксперименту осуществляется, как указано выше. На исследование отбирается 50л воздуха (объем пробы).
Последовательность отбора проб следующая:
1 – проведение контроля обсемененности воздуха до начала распыления суспензии тест-микроорганизмов;
2 – проведение контроля обсемененности воздуха после распыления суспензии тест-культуры;
3- проведение контроля эффективности обеззараживания воздуха - отбор проб через каждые 5-10 мин в зависимости от предполагаемой эффективности ДС.
После отбора проб жидкость из 2-х склянок Дрекселя смешивают и по 1мл вносят в пробирки со скошенной питательной средой. Посевы помещают в термостат. Предварительный учет результатов проводят через 10-14 суток, окончательный – через 21 сутки.
Критерий эффективности обеззараживания воздуха – 100%.
7. Методы исследования и оценки туберкулоцидной активности ДС
в практических условиях
Практические испытания проводятся в тех случаях, когда ДС содержит новое действующее вещество и требуется подтверждение эффективности разработанных в лабораторных условиях режимов в отношении возбудителей туберкулеза и микобактериозов.
Испытания проводят в соответствии с Инструкцией по испытанию ДС, оценивая туберкулоцидную эффективность, безопасность применения и надежность рекомендованных мер предосторожности, физико-химические качества ДС: растворимость, запах, наличие моющего действия и пр.
При оценке эффективности ДС предварительно оценивают обсемененность объектов окружающей среды, имеющих эпидемиологическое значение при туберкулезе, до проведения дезинфекции (фон) и сравнивают ее с обсемененностью этих объектов после обработки рабочим раствором ДС.
Эффективным считают средство, после обработки которым в соответствии с режимом, указанным в Инструкции, на объектах не обнаруживают возбудителей туберкулеза, микобактериозов и S.aureus.
По завершении испытаний оформляется акт испытаний, в котором отражаются указанные выше параметры и другие отмеченные свойства.
8. Нормативные ссылки
1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»
2. Постановление Правительства от 04.04.2001 г. № 262 «О государственной регистрации отдельных видов продукции, представляющих потенциальную опасность для человека, а также отдельных видов продукции, впервые ввозимых на территорию Российской Федерации»
3. «Нормативные показатели безопасности и эффективности дезинфекционных средств, подлежащих контролю при проведении обязательной сертификации» № 01-12/75-97.
4. Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств. Утв. МЗ СССР 06 мая 1968 г., № 739-68.
5. Методические указания по оценке дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания различных объектов и санитарной обработки людей. Утв. МЗ СССР 20 августа 1970 г., № 859-70.
6. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности. Утв. МЗ РФ, 1998 г.
7. СП 1.3.232-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
8. Стандарт Европейского комитета по стандартизации NEN-EN 14476
Приложения
Приложение 1.
Характеристика тест-микроорганизмов по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам
Mycobacterium В5 представляют собой полиморфные, неподвижные, неспорообразующие палочки, размером 0,2-0,6х1-10 мкм (как и другие виды микобактерий). Mycobacterium В5 – грамположительные, аэробы, растут на элективных питательных средах на яичной основе (реакция среды почти нейтральная (рН 6,8-7,2)): Левенштейна-Йенсена, «Новая», Петраньяни и др. при оптимальной температуре 370С, хотя могут расти при температуре 25-38ºС. Колонии Mycobacterium В5 на плотных питательных средах представляют собой шероховатые, матовые, выпуклые образования ярко оранжево-желтого цвета. Оранжево-желтая окраска колоний обусловлена пигментом, который образуется при культивировании Mycobacterium В5 в темноте. Длительность роста Mycobacterium В5 на питательных средах составляет от 5-х до 7-ти суток. На элективных синтетических питательных средах (например, Миддлбрука 7Н9 с 10% ростовой добавки ADC, 7Н10 с 10% ростовой добавки ОADC) Mycobacterium В5 растет плохо или вообще не растет.
В мазках из молодых культур Mycobacterium В5 имеют вид коротких, толстых палочек, расположенных поодиночке. В старых культурах имеют овоидную, колбовидную или веретенообразную форму. Окрашиваются по Циль-Нильсену в малиново-красный цвет.
Mycobacterium В5 проявляют более выраженную каталазную активность, чем вирулентные виды микобактерий, и в большей степени, чем последние, разлагают перекись водорода. Пероксидаза Mycobacterium В5 более устойчива к температурным воздействиям, чем таковая вирулентных микобактерий. Mycobacterium В5 не свертывают молоко, не разжижают желатины.
По классификации патогенных для человека микроорганизмов Mycobacterium В5, как и все микобактерии, относятся к IV группе опасности, являются непатогенными микроорганизмами.
Mycobacterium В5 используют для оценки эффективности камерного обеззараживания вещей, одежды и других объектов как наиболее адекватную модель возбудителя туберкулеза к температурному воздействию.
Тест-микроорганизм Mycobacterium В5 хранится в музее Федерального государственного учреждения науки «Научно-исследовательский институт дезинфектологии» Роспотребнадзора (117246, Москва, Научный проезд, д. 18).
Mycobacterium terrae (АТСС 15755, DSM 43227) представляют собой короткие прямые палочки малиново-красного цвета, располагающиеся в мазке параллельно друг другу, наподобие частокола. Микобактерии M. terrae неподвижные, грамположительные, не образующие спор и капсул. В связи с высоким содержанием миколовых кислот плохо окрашиваются обычными методами, но хорошо окрашиваются по Циль-Нильсену в малиново-красный цвет.
Микобактерии M. terrae – аэробы, температурные границы роста - от 250С до 370С, оптимальная температура – 370С.