Смекни!
smekni.com

Методические указания му 1 5-09 Издание официальное Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2009 г (стр. 12 из 13)

M. terrae требовательны к питательным средам, растут на элективных средах (реакция среды почти нейтральная (рН 6,4-7,0): Левенштейна-Йенсена, «Новая», Миддлбрука 7Н9 с 10% ростовой добавки ADC, 7Н10 с 10% ростовой добавки ОADC и др. Колонии M. terrae на среде Левенштейна-Йенсена - шероховатые и матовые выпуклые округлые образования, на среде «Новая» - гладкие и блестящие или с молочным или желтоватым оттенком. Длительность роста M. terrae на питательных средах зависит от состава среды. При оптимальной температуре икубирования на «богатых» питательных средах Левенштейна-Йенсена и «Новая» рост M. terrae может появиться на 5-7 сутки. На «голодных» питательных средах инкубация M. terrae составляет до 8 недель.

M. terrae гидролизуют Твин 80 (т.к. продуцируют липазы), имеют высокоактивную каталазу и проявляют β-галактазную активность. Восстанавливают теллурит калия до металлического теллура в течение 9 дней.

По классификации патогенных для человека микроорганизмов относится к IV группе опасности, является непатогенным микроорганизмом.

Mycobacterium terrae используют для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций.

Тест-микроорганизм M. terrae хранится в Американской коллекции типичных культур (American Type Culture Collections); Немецком музее микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ - Deutcshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) и в других организациях.

Приложение 2.

Методики приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций

Методика приготовления среды Петраньяни

В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:

1) Пептон – 2г

Крахмал- 12 г

Молоко – 300 мл

Яйца – 10 шт.

Картофель – 2 шт.

Малахитовый зеленый — 2 г

Глицерин- 24 мл

Вода -100мл

2). В стерильную колбу (1л) помещают 12 г крахмала и 2 г пептона. Затем добавляют 2 шт. мелко нарезанного картофеля (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят). Доливают в колбу 300 мл свежего цельного молока и подогревают на водяной бане в течение часа (с момента начала свертывания молока) при постоянном помешивании. В другую стерильную колбу разбивают 8 диетических яиц и 2 желтка. Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 минут в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Яйца тщательно взбивают до однородной массы и переливают в колбу со смесью крахмала, пептона, картофеля и молока. Сюда же добавляют 24 мл глицерина и 16 мл 2% раствора малахитовой зелени. Полученную смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлевый фильтр в стерильную колбу. Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа “АСПС”. Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8 – 10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 850С в течение 45 минут.

3). Приготовление раствора малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый — 2 г

Стерильная дистиллированная вода — 100 мл

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 часа для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

Методика приготовления картофельно-глицеринового бульона

Готовят картофельный отвар. На 1 л питьевой воды берут 200г очищенного (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят) картофеля, отваривают в течение 30 мин с момента закипания, остужают и отстаивают. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят водой до первоначального объема, добавляют 10 мл глицерина. рН картофельного бульона 7,0-7,2. Бульон стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут.

Методика приготовления картофельно-глицеринового агара

В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:

Картофельно-глицериновый бульон

Пептон-5г

Мел- 1г

Агар-агар -20г

Вода – 1 л

К картофельно-глицериновому бульону добавляют 5г пептона, 20г агар-агара, 1 г мела, устанавливают рН 7,0-7,2. Агар расплавляют и разливают в пробирки или колбы. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут.

Методика приготовления среды Миддлбрука 7 H 9 (бульон) с 10 % ADC ростовой добавкой (MADC-бульон для хранения замороженных культур при минус 70ºС)

Миддлбрук 7H9 порошок бульона 4,7 г

Глицерин 3Н8О3) 100,0 мл

Вода (стерильная, дистиллированная) 750,0 мл

Ингредиенты соединить, перемешать, стерилизовать в паровом стерилизаторе при 1,1 атм. (121°С) в течение 10 минут, охладить до 45ºC. Добавить в асептических условиях 100 мл ростовой добавки ADC и стерильной дистиллированной воды до 1000,0 мл.

pH среды будет эквивалентен 6,6 ± 0,2 в бульоне, остывшем до 25ºC.

Методика приготовления среды Левенштейна-Йенсена

Среда Левенштейна-Йенсена – международная среда, широко используемая в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности.

Это плотная яичная среда, на которой видимый рост M. terrae получают приблизительно на 14-21-й день после посева.

Для чистоты эксперимента желательно использовать готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками.

При невозможности приобретения готовой среды, ее можно приготовить самостоятельно.

В состав среды Левенштейна-Йенсена входят следующие компоненты:

Раствор минеральных солей:

Калий однозамещенный фосфорнокислый 2,4 г

Магний лимоннокислый 0,6 г

Магний сернокислый 0,24 г

L- аспарагин 3,6 г

Глицерин 12,0 мл

Вода дистиллированная 600 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. L-аспарагин рекомендуется растворять отдельно и вносить последним. Затем солевой раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 20 - 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый — 2 г

Стерильная дистиллированная вода — 100 мл

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 часа для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

Яичная масса

Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 минут в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20–25 яиц, в зависимости от их величины). Тщательно взбивают яичную массу стерильным венчиком или в стерильном миксере при минимальной скорости.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают следующие растворы:

Раствор минеральных солей — 600 мл

Гомогенизированная яичная масса — 1000 мл

Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через 4-х слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 минут разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Коагуляция (свертывание) среды.

Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа “АСПС”. Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8 – 10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 850С в течение 45 минут.

Хранение среды.

Готовую питательную среду проверяют на стерильность, помещая 10 пробирок из вновь приготовленной партии в термостат при 370С на 3 суток. По истечении времени инкубации в пробирках на питательной среде должен отсутствовать микробный рост. В случае наличия роста приготовленная партия среды подлежит уничтожению. Приготовленная партия среды должна иметь этикетку с датой изготовления и сохраняться в холодильнике при 40С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.

Методика приготовления среды «Новая»

Среда «Новая» - это плотная яичная среда, на которой хороший рост колоний M. terrae получают приблизительно на 5-7-й день после посева материала (проб).

В рецептуру питательной среды «Новая» входят следующие компоненты

(в весовых %):

Калий фосфорнокислый одноосновной 0,05
Натрий лимоннокислый 0,05
Магний сернокислый 0,05
Натрий пировинограднокислый (гликокол) 0,2
Глицерин 3,6
Малахитовая зелень 0,036
Желтки яиц 50,0
Дистиллированная вода до 100,0

Способ получения концентрированной питательной среды заключается в смешивании сухих навесок ингредиентов солей (кроме бактерицидного красителя) с желточной массой, обработки ингредиентов 70º этиловым спиртом, растворении бактерицидного красителя в глицерине и соединении всех компонентов среды.