ДС, обладающие туберкулоцидной активностью, необходимы для обеззараживания различных объектов, контаминированных возбудителем туберкулеза, отличающегося от всех других вегетативных форм болезнетворных бактерий более высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам, в том числе к дезинфицирующим средствам.
Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в мире в настоящее время остается напряженной, кроме того, она усугубляется появлением и распространением суперустойчивых к химическим противотуберкулезным веществам форм возбудителя. Такие микобактерии зачастую характеризуются более высокой сохраняемостью во внешней среде, что приводит к возникновению внутрибольничных вспышек нозокомиального туберкулеза. Кроме того, все чаще стали регистрироваться случаи заболеваний, вызванных нетуберкулезными видами микобактерий (НТМБ), которые обладают естественной резистентностью к воздействию негативных факторов окружающей среды. НТМБ являются возбудителями микобактериозов человека и наиболее опасны для больных с иммунодефицитными состояниями, т.к. существенно сокращают сроки их жизни.
В такой неблагоприятной эпидемической ситуации по туберкулезу и микобактериозам возрастает роль неспецифических противоэпидемических мероприятий, среди которых ведущую роль занимает химическая дезинфекция, направленная на уничтожение возбудителей на объектах внешней среды, имеющих значение в передаче инфекции.
Как известно, успех проведения химической дезинфекции напрямую зависит от соблюдения рекомендаций Инструкций по применению дезинфицирующих средств, правильного выбора эффективного режима (концентрация, экспозиция, способ обработки). Помимо этого дезинфекционные мероприятия будут эффективны лишь в том случае, когда режимы дезинфекции отработаны на адекватном по устойчивости реальным возбудителям тест-микроорганизме.
В нашей стране для разработки туберкулоцидных режимов применения ДС используют сапрофитный штамм Mycobacterium В5, который изначально был предложен как тест-микроорганизм для оценки качества проведения камерной дезинфекции в очагах туберкулеза, поскольку обладал естественной резинстентностью к температурному фактору /2,3/. Более того, результаты исследований по сравнительной оценке устойчивости микобактерий к химическим веществам, проведенные в 50-60гг прошлого столетия, свидетельствуют о меньшей устойчивости Mycobacterium В5по сравнению с вирулентными штаммами микобактерий. Обоснованных экспериментальных данных по выбору Mycobacterium В5 для оценки туберкулоцидной активности химических средств дезинфекции в открытой литературе не найдено.
За рубежом для разработки туберкулоцидных режимов применения ДС используют такие штаммы как M. Terrae и M.avium /4/. Насколько чувствительность к ДС всех перечисленных тест-микобактерий адекватна реальным возбудителям туберкулеза и микобактериозов сказать трудно, поскольку такие сведения в литературе отсутствуют.
В связи с вышесказанным, представлялось актуальной задачей для дезинфектологии и фтизиатрической практики проведение экспериментов по сравнительной оценке чувствительности тест-микобактерий к воздействию ДС разных химических групп.
Исследования, проведенные в НИИД и на базе лаборатории микробиологии и ПЦР диагностики Уральского НИИ фтизиопульмонологии, г. Екатеринбург, показали, что Mycobacterium В5 является самым чувствительным видом микобактерий к воздействию большинства ДС. Наиболее устойчивыми оказались M. Terrae, M. Avium-intracellulara и M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.
Тест-микроорганизм M. Terrae является наиболее подходящей моделью для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС, поскольку в наибольшей степени соответствует устойчивости патогенных микобактерий.
На основании этих данных, а также учитывая, что сапрофитные микроорганизмы более удобны и безопасны в работе, чем патогенные виды микобактерий, наиболее адекватной моделью для тестирования химических ДС является M. Terrae. При оценке туберкулоцидной эффективности физических (температурных) методов дезинфекции в качестве тест-микроорганизмов рекомендуется использовать Mycobacterium В5 .
Данные методические указания регламентируют методы и технологию изучения, а также оценки туберкулоцидной активности субстанций для производства ДС, туберкулоцидной активности и эффективности химических, физических и комбинированных ДС при обеззараживании различных объектов, контаминированных наиболее устойчивым видом микобактерий с учетом максимально возможного уровня контаминации объектов возбудителем туберкулеза в практических условиях.
Исследования туберкулоцидной активности субстанций, ДС и эффективности режимов применения ДС включают:
- выбор и подготовку культур тест-микроорганизмов для изучения туберкулоцидной активности ДС и субстанций;
- обеспечение стандартности условий проведения исследований туберкулоцидной активности ДС и субстанций;
- методы исследований и оценки результатов туберкулоцидной активности ДС и субстанций in vitro (суспензионный метод, метод батистовых тест-объектов);
- методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС с использованием искусственно контаминированных тест-микобактериями различных тест – объектов с целью разработки режимов обеззараживания тех или иных объектов в отношении возбудителя туберкулеза (поверхностей в помещениях, транспорта, санитарно-технического оборудования, мебели, посуды, белья, одежды, предметов ухода за больными, медицинских приборов, инструментов и других изделий медицинского назначения и т.д.);
- методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС в практических условиях.
3. Тест-микроорганизмы для изучения и оценки туберкулоцидной
активности дезинфицирующих средств и их субстанций
К применению в отечественной медицинской практике для дезинфекции при туберкулезе предлагаются различные ДС как отечественного, так и зарубежного производства, имеющие туберкулоцидные режимы, разработанные с использованием наиболее устойчивых тест-микроорганизмов, что должно гарантировать их эффективность в отношении возбудителя.
Исследование и оценку туберкулоцидной и микобактерицидной (в отношении непатогенных микобактерий) активности ДС, предлагаемых для применения на территории России, проводят, используя в качестве тест-микроорганизмов:
- агаровую культуру Mycobacterium В5 для оценки эффективности и разработки туберкулоцидных режимов камерного обеззараживания различных объектов;
- агаровую культуру Mycobacterium terrae (DSM 43227) для оценки активности ДС и разработки режимов их применения при обеззараживании в отношении возбудителя туберкулеза и микобактериозов;
- агаровую культуру Mycobacterium tuberculosis для подтверждения эффективности разработанных режимов применения ДС в отношении возбудителей туберкулеза и микобактериозов в практических условиях.
3.1. Требования к тест-микроорганизмам
Тест-микобактерии должны иметь типичные морфологические, культуральные, биохимические, тинкториальные и ферментативные свойства, присущие данному штамму (см. Приложение 1), и обладать стандартной устойчивостью к эталонным ДС и температуре. Культура Mycobacterium В5 должна быть .устойчива к температуре 600С в течение 60 мин. Показатели устойчивости к химическим дезинфицирующим средствам, которым должна соответствовать культура Mycobacterium terrae приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Устойчивость Mycobacterium terrae к эталонным дезинфицирующим агентам и средствам
| Действующее вещество | Концентрация раствора, % | Время гибели Mycobacterium terrae, не менее (мин) |
| Хлорамин Б (28,0% по активному хлору) | 5,0 | 120 |
| Глутаровый альдегид | 0,5 | 60 |
| Перекись водорода | 4,0 | 60 |
Тест-микобактерии М.terrae могут быть приобретены в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) в Немецком музее микроорганизмов и клеточных культур (Deutcshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) под № DSM 43227. Тест-микобактерии штамма В5 могут быть приобретены в коллекции музея микроорганизмов ФГУН Научно-исследовательского института дезинфектологии (ФГУН НИИД) Роспотребнадзора.
3.2. Получение и хранение исходной рабочей культуры тест- микобактерий
Для выращивания культур тест-микобактерий используют плотные питательные среды. Перечень и методика приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций, приведены в Приложении 2. В отличие от питательных сред, рекомендуемых в стандарте NEN-EN 14476, использование приведенных в приложении питательных сред позволяет получать результат оценки туберкулоцидной активности ДС не на 21 сутки, а на 10-14 сутки.
Для получения культуры штамма тест-микобактерий ампулу с лиофилизированной музейной культурой этого штамма вскрывают в асептических условиях следующим образом: ватным тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы, затем нагревают ее запаянный конец в пламени горелки до образования на ампуле трещины. К накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой. После этого ударом металлическим инструментом (скальпель, пинцет) по трещине откалывают конец ампулы. Стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 1,0 мл стерильной дистиллированной воды и оставляют в течение 30 мин при комнатной температуре для растворения лиофилизата и получения суспензии. Суспензию, приготовленную из музейной тест-культуры, рассевают по 0,1 мл в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или «Новая» (всего 10 пробирок). Посевы инкубируют в термостате при 370С в течение 5-7 суток.