Методические указания му 1 5-09 Издание официальное Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2009 г (стр. 3 из 13)

С выросшими культурами М. terrae на питательных средах далее работают следующим образом:

-полученную биомассу снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с поверхности питательной среды Левенштейна-Йенсена или «Новая» со всех пробирок;

-помещают в пробирку с 10 мл бульона Миддлбрука 7Н9 с 10% ADC ростовой добавкой и гомогенизируют;

-доводят объем полученной суспензии до 100 мл бульоном Миддлбрука 7Н9 и по 0,5 мл суспензии вносят в микропробирки;

-подписывают на каждой пробирке наименование штамма и дату;

-замораживают при минус 70⁰С и оставляют в таком состоянии для длительного хранения.

Это самый эффективный способ длительного (десятилетиями) хранения культур с обеспечением сохранения биологических свойств тест-микобактерий. При отсутствии такой возможности, суспензию в микропробирках замораживают в бытовом холодильнике при минус 20ºС. Срок хранения культуры в таких условиях– не более 5 лет.

Данная методика получения и хранения исходной рабочей культуры тест-микобактерий позволяет длительный период времени проводить испытания ДС с максимальным обеспечением стандартности свойств тест-микобактерий, в том числе по устойчивости к различным факторам, поскольку исключает необходимость многократного пересева, приводящего, как известно, к изменению биологических свойств микроорганизмов.

Полученная и хранящаяся таким образом культура тест-микобактерий используется для получения агаровой культуры тест-микобактерий (первый пассаж) и приготовления из нее рабочей суспензии тест - микобактерий, используемой для проведения испытаний ДС.

3.3. Приготовление рабочей суспензии тест-микобактерий, используемой в эксперименте при испытании дезинфицирующих средств и контроль ее качества.

Для получения первого пассажа культуры тест-штамма микобактерий, используемой при оценке ДС, необходимое для исследования количество хранящихся при температуре минус 70ºС или минус 20ºС микропробирок (2 штуки на 1 исследование) с данным штаммом микобактерий размораживают при комнатной температуре, переносят по 0,1 мл содержимого в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или «Новая» и инкубируют в термостате при 37 ºС в течение 14 суток. Выросшую на плотной питательной среде в пробирках культуру используют для приготовления рабочей суспензии тест-микобактерий данного штамма.

Одна или несколько пробирок может быть использована для получения второго пассажа культуры тест-микобактерий этого штамма. Для этого культуру первого пассажа в пробирке снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с плотной питательной среды, помещают в толстостенную стеклянную пробирку и тщательно растирают, постепенно добавляя по каплям стерильную дистиллированную воду. Полученную суспензию рассевают на плотную питательную среду тем же способом, который использовался для получения первого пассажа.

Культуры тест-микроорганизмов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур микобактерий тест-штаммов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды. Проводят микроскопию мазка выросших культур методом окраски по Циль-Нильсену (M.terrae представляют собой короткие прямые палочки малиново-красного цвета, располагающиеся в мазке параллельно друг другу, наподобие частокола. Размер клеток микобактерий 0,2-0,6х1-10 мкм).

Рабочую суспензию культуры тест-микобактерий готовят из тест-штамма первого и/или второго пассажей, выросших на плотной питательной среде. Дальнейшее субкультивирование недопустимо!

Для приготовления рабочей суспензии культуру микобактерий снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с плотной питательной среды и помещают в толстостенную стеклянную пробирку. Микробную биомассу тщательно гомогенизируют, постепенно добавляя по каплям стерильную дистиллированную воду. Густую исходную бактериальную суспензию оставляют на 15 минут для осаждения негомогенизированных конгломератов и частиц. Полученную надосадочную жидкость отбирают пастеровской пипеткой, переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности (ФГУН Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора) и стандартизуют по оптическому стандарту мутности № 10 (он соответствует 1·10⁹ микробных тел в 1 мл), добавляя стерильную дистиллированную воду.

Суспензия, содержащая такое количество живых микробов, при контаминации ею батистовых тест-объектов, тест-поверхностей и др. обеспечивает требуемые (порядка 1·10⁵-1·10⁶ КОЕ/см^-2) уровни их обсеменения живыми клетками тест-микроба.

Однако в связи с тем, что микобактерии могут отмирать в результате хранения или по иным причинам, а мертвые микроорганизмы, присутствующие в суспензии, будут, как и живые, давать помутнение суспензии, необходимо осуществлять бактериологический контроль фактического количества живых клеток в приготовленной суспензии, чтобы, при необходимости, внести коррективы и обеспечить требуемые уровни контаминации тест-объектов жизнеспособными микобактериями.

3.4. Определение биологической концентрации тест-микроба
в рабочей суспензии

Из суспензии, приготовленной по оптическому стандарту мутности № 10 (10⁹ КОЕ·мл^-1), делают, как показано на схеме 1, разведения с 10-кратным шагом до 10³ микробных клеток в 1 мл (посев 0,1 мл суспензии из этого разведения на плотную питательную среду позволяет произвести достаточно точный подсчет выросших на среде колоний микобактерий, количество которых будет находиться в пределах 100 единиц).

Схема 1.

Проведение эксперимента по контролю количества живых микобактерий в рабочей суспензии тест-микобактерий, используемой для оценки туберкулоцидной активности ДС

Разведения готовят следующим образом:

1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл Пробирки с плотной

1 мл питательной средой

по 0,1 мл

Суспензия по 1 2 3 4 5 6 Пробирки с 9 мл

стандарту мутности №10 № разведения стерильной дист.водой

(10⁹ КОЕ/мл)

Первое разведение соответствует 10⁸ КОЕ/мл, а шестое -10³ КОЕ/мл. Из этого разведения производят посев по 0,1 мл на 5 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена или «Новая», инкубируют в термостате при 37⁰С в течение 5-7 суток. Подсчитывают количество выросших колоний на среде в пробирке, рассчитывают среднее значение из 5 и делают пересчет количества жизнеспособных клеток в исходной суспензии, учитывая коэффициент разведения. Количество жизнеспособных клеток в рабочей суспензии должно быть 10⁹ КОЕ/мл.