Посев суспензии в пробирки со скошенной плотной питательной средой позволяет существенно экономить расход среды и избежать пересыхания и растрескивания среды, наблюдаемого при использовании чашек Петри с плотной питательной средой.
Расчет количества жизнеспособных бактериальных клеток в приготовленной исходной суспензии осуществляют по следующей формуле:
Х = А х 107, где
Х - количество жизнеспособных бактериальных клеток в 1 мл приготовленной суспензии;
А – среднее количество колонии образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 чашках Петри;
107 – коэффициент пересчета, учитывающий степень разведения суспензии (106) и объем, использованный для посева (0,1 мл).
Например: получен рост микобактерий в первой пробе - 70 КОЕ, во 2-ой – 130 КОЕ, в 3-ей – 99 КОЕ, в 4-ой – 115 КОЕ, в 5-ой – 97 КОЕ, тогда среднее количество колонии образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 пробирках будет равно: А=(70+130+99+115+97):5 = 102
Х = 102 х 107 = 109 микробных тел в 1 мл, что соответствует оптическому стандарту мутности № 10 (1 млрд. микробных тел (109) в 1 мл.
3.5. Методики определения устойчивости тест-микобактерий
3.5.1. Определение устойчивости тест-микобактерий к воздействию температуры.
В стерильный стеклянный стакан объемом 100 мл наливают 50 мл стерильной дистиллированной воды и помещают в водяную баню. Рядом с ним в водяной бане помещают стеклянный стакан объемом 100 мл с 50 мл дистиллированной воды и с помещенным в нее термометром, позволяющим измерять температуру до 1000С. Включают водяную баню, доводят температуру воды в стакане до 600С и поддерживают эту температуру на протяжении всего эксперимента.
В стерильные пробирки разливают по 5 мл стерильной дистиллированной воды комнатной температуры (количество пробирок соответствует количеству отбираемых в опыте проб). Исходя из количества проб, готовят пробирки со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или «Новая». Готовят и контаминируют тест-микроорганизмами батистовые тест-объекты (см. п. 5.2). Если в опытах используют ранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике контаминированные микобактериями тест-объекты, то их заранее извлекают из холодильника, чтобы они приобрели комнатную температуру (18-200С).
Отсчитывают в чашке Петри необходимое для опыта количество батистовых тест-объектов (по 2 на каждую экспозицию), контаминированных тест-микобактериями, захватывают тест-объекты стерильным пинцетом все сразу и опускают их в стакан со стерильной дистиллированной водой, нагретой в водяной бане до 600С. Легким покачиванием емкости добиваются полного смачивания тест-объектов. В момент смачивания всех тест-объектов отмечают время.
Через каждые 15 минут стерильным пинцетом извлекают по 2 тест-объекта и опускают их в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды при температуре 20±2 0С для нейтрализации действия температурного фактора. Через 5 минут каждый тест-объект помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.
Для контроля два контаминированных тест-микобактерией тест-объекта погружают в стерильную дистиллированную воду при температуре 20±2 0С на максимальный срок экспозиции, затем (как и опытные тест-объекты) их помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.
Посевы опытные и контрольные ставят в термостат при температуре 370С; наличие роста тест-культур проверяют через 10-14 суток.
Опыт повторяют не менее 3 раз. Тест-микобактерии должны быть устойчивы к нагреванию при 600С не менее 1 часа.
3.5.2 Определение устойчивости тест-микобактерий к эталонным дезинфицирующим средствам
Для определения устойчивости микобактерий в качестве эталонных ДС используют монохлорамин Б, глутаровый альдегид и перекись водорода медицинскую.
Методом йодометрического титрования определяют процент активного хлора в монохлорамине Б. В опытах используют препарат, содержащий 26,0-28,0% активного хлора, растворяя который в дистиллированной воде в соотношении 1:20 готовят рабочий раствор (5,0% по препарату).
Глутаровый альдегид (зарегистрированный в России как субстанция) разводят дистиллированной водой до концентрации рабочего раствора 0,5% (по глутаровому альдегиду).
Массовую долю перекиси водорода медицинской определяют методом перманганатометрического титрования в соответствии с ГОСТ 177-88. Готовят 4,0% раствор (по перекиси водорода).
Предварительно готовят и разливают в пробирки по 5 мл стерильный раствор нейтрализатора (1,0% раствор тиосульфата натрия); стерильную питьевую воду; пробирки со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или «Новая». Готовят и контаминируют тест-микобактериями батистовые тест-объекты (см. п. 5.2.). Если в опытах используют ранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике контаминированные тест-микробом тест-объекты, то их заранее извлекают из холодильника, чтобы они приобрели комнатную температуру (18-200С).
Перед постановкой опыта контролируют содержание ДВ в рабочем растворе ДС.
При проведении экспериментов в стеклянную емкость объемом 50-100 мл пипеткой наливают требуемый объем раствора эталонного ДС, из расчета 0,5 мл на каждый тест-объект и помещают в водяную баню с температурой 20оС на весь период опыта. Отсчитывают в чашке Петри необходимое для опыта количество батистовых тест-объектов (по 2 на каждую экспозицию), контаминированных тест-микобактериями, захватывают стерильным пинцетом тест-объекты все сразу и опускают их в емкость с раствором ДС; легким покачиванием емкости добиваются полного смачивания тест-объектов. В момент смачивания всех тест-объектов отмечают время.
Через каждые 30 минут стерильным пинцетом извлекают по 2 тест-объекта из раствора ДС и опускают их в пробирку с 5 мл 1,0% стерильного раствора тиосульфата натрия для нейтрализации остаточного действия ДС. Пробирку с нейтрализатором и тестами не подвергают встряхиванию. Через 5-10 минут тест-объекты переносят в пробирку с 5 мл стерильной питьевой воды. Еще через 10-15 минут каждый тест-объект помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.
Для контроля два контаминированных тест-микобактериями тест-объекта погружают в стерильную воду (вместо раствора ДС) на максимальный срок экспозиции, затем (как и опытные тест-объекты) их переносят в раствор нейтрализатора (тиосульфат натрия) и помещают на поверхность скошенной в пробирке плотной питательной среды.
Посевы опытные и контрольные ставят в термостат при температуре 370С; наличие роста тест-культур проверяют через 10-14 суток.
Опыт повторяют не менее 3 раз. Тест-микобактерии должны быть устойчивы к 5,0% раствору монохлорамина не менее 2 часов; к 0,5% раствору глутарового альдегида - не менее 60 мин; к 4,0% раствору перекиси водорода – не менее 60 мин.
В процессе испытаний контролируют температуру раствора ДС в опыте, исходный и остаточный уровень контаминации тест-микобактериями тест-объекта (КОЕ на см2), время выдержки тест-объектов в испытуемом дезинфицирующем растворе.
4. Обеспечение стандартности условий проведения исследований
туберкулоцидной активности ДС и их субстанций
Для обеспечения стандартности условий постановки экспериментов необходимо провести химико-аналитический контроль исследуемых ДС и их субстанций. До проведения исследования туберкулоцидной активности ДС и их субстанций необходимо ознакомиться с рецептурой средства и техническими условиями на отечественные или спецификацией на зарубежные средства, провести химико-аналитические исследования по определению концентрации действующих веществ в средствах и определить соответствие рецептуры и других показателей, регламентированным вышеуказанными документами. При этом используют химико-аналитические методы контроля и применяют условия хранения средства и меры безопасности при работе с ним, предложенные производителем средства.
Так как для дезинфекции при туберкулезе применяют средства, обладающие действием, убивающим микобактерии, а не задерживающие их рост, при определении туберкулоцидной активности и эффективности ДС необходимо разграничить туберкулоцидное действие препарата от туберкулостатического. Для этого применяют нейтрализторы, исключающие остаточное бактерицидное действие.
Для нейтрализации антимикробного действия дезинфицирующих средств из различных химических групп применяют следующие нейтрализаторы /2/:
- для средств из группы окислителей (хлор-, йод-, перекись содержащие средства; средства, содержащие надуксусную кислоту, озон) – 0,5-1,0% растворы тиосульфата натрия;
- для альдегид- и фенолсодержащих средств – универсальный нейтрализатор, содержащий 3% твина-80, 3% сапонина, 0,1% гистидина и 0,1% цистеина;
- для катионных поверхностно-активных веществ – 0,1-1,0% растворы сульфонола или 0,5-1,0% растворы сульфонола с 10% обезжиренным молоком;
- для композиционных средств – универсальный нейтрализатор, например, содержащий 3% твина-80, 3% сапонина, 0,1% гистидина и 0,1% цистеина. Универсальным нейтрализатором является также нейтрализующий бульон по Ди-Ингли (фирма-производитель «HIMEDIA»). В его состав входят такие ингредиенты, как гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкоза, натрия тиосульфат, натрия тиогликолят, натрия бисульфит, лецитин, Твин-80 и др.
Растворы нейтрализаторов готовят в асептических условиях, применяя для этого только стерильную дистиллированную воду.
При невозможности соблюдения асептических условий приготовления нейтрализаторов, допускается стерилизация готовых растворов автоклавированием при 1,1 атм. (1210С) в течение 15 мин.