Методические указания му 1 5-09 Издание официальное Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2009 г (стр. 6 из 13)
- перемешивание пробы путем встряхивания вручную в течение 1-2 минут (или в течение 5 минут на шейкере) и посев из них стерильно на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри или в пробирках (по 0,1 мл на каждую чашку или пробирку, но не менее чем на три из каждой пробы).
- инкубирование посевов проб при температуре 37±10С в течение 10-21 суток и учет результатов.
Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие жизнеспособных клеток в посевах соответствующих им проб.
Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляется отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе учета данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.
Средство, растворы которого обеспечивают при комнатной температуре в течение 60 минут полную гибель микобактерий, рассматривают как перспективное туберкулоцидное средство для дальнейшего изучения: оценки факторов, влияющих на туберкулоцидную активность ДС, отработки режимов эффективного применения и др.
5.2. Метод батистовых тест-объектов
Как суспензионный метод оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций, так и метод батистовых тест-объектов /5/ используют для получения информации о концентрационных и временных параметрах эффективного туберкулоцидного действия ДС. В принципиальном плане методология выполнения эксперимента по оценке (тестированию) туберкулоцидной эффективности ДС методом батистовых тест- объектов приведена на схеме 4.
Как видно из схемы 4, методика эксперимента предусматривает проведение контаминации микобактериями батистовых тест-объектов, контроля исходного уровня обсеменения тест-объектов, обработки (замачивания) тест-объектов в испытываемом дезинфицирующем растворе, нейтрализации ДС после заданной экспозиции воздействия, инкубирование нейтрализованных тест-объектов на плотной питательной среде.
Схема 4.
Выполнение эксперимента по оценке туберкулоцидной активности
дезсредства методом батистовых тест-объектов
 |  | ||||||
 | |||||||
 | |||||||
 | |||||||
Разведение и посев пробы 
Приготовление и контаминация батистовых тест-объектов
Батистовую ткань погружают на 24 часа в холодную питьевую воду для удаления аппрета. Затем ткань тщательно стирают с мылом, прополаскивают в холодной воде, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске батистовой ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 10 мм друг от друга и в поперечном - на расстоянии 5 мм друг от друга. По этим линиям ткань разрезают ножницами на отдельные тест-объекты; раскладывают по 50 штук в чашки Петри, которые завертывают в бумагу и автоклавируют в паровом стерилизаторе 20 минут при 1320 С (1,1 кгс/см2).
Приготавливают рабочую суспензию тест-микобактерий (см. п.3.3.) в количестве, достаточном для контаминации используемых в опыте тест-объектов (из расчета 0,2 мл на тест).
Стерильные батистовые тест-объекты (в количестве 50-100 штук) в чашке Петри заливают 10 - 20 мл рабочей суспензии тест-микобактерий, содержащей 109 КОЕ/мл, и равномерно смачивая, оставляют тест-объекты в суспензии в закрытой чашке Петри. Через 30 минут тест-объекты, контаминированные бактериальной суспензией, стерильным пинцетом с соблюдением асептики переносят в стерильную чашку Петри на поверхность двухслойной стерильной фильтровальной бумаги, покрывают их сверху стерильной фильтровальной бумагой и закрывают чашку. Оставляют на 10 минут с целью удаления избытка жидкости. Для фиксации микроорганизмов на батистовых тест-объектах, последние переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 370С в течение 20 минут с приоткрытыми крышками.
Хранение контаминированных тест-объектов возможно в холодильнике при температуре 4±20С в течение суток.
Контроль исходного количества живых тест-микобактерий
на тест-объекте
Для контроля количества жизнеспособных микобактериальных клеток на тест-объектах, тест-объект погружают в колбу со 100 мл стерильной дистиллированной воды. Колбу устанавливают на шейкер и встряхивают в течение 30 минут для отмывания бактериальных клеток с бязевого (батистового) тест-объекта. Из полученной суспензии производят посев по 0,1 мл на 5 пробирок (5 повторностей) со средой Левенштейна-Йенсена или «Новая», инкубируют в термостате при 370С в течение 14-21 суток. Выросшие колонии на поверхности питательной среды подсчитывают, определяют среднее значение, производят пересчет с учетом разведения. Количество жизнеспособных бактериальных клеток в приготовленной суспензии на тест-объекте должно составлять 105-106 микробных тел. Если рост микобактерий отсутствует, при посеве суспензии объемом 0,1 мл, можно увеличить объем до 0,2-0,3 мл и соответственно учесть его при расчете бактериальной концентрации на тест-объекте.
Расчет концентрации живых микобактерий на тест-объекте осуществляют по следующей формуле:
X = А х 1000, где
X - концентрация живых микобактерий на тест-объекте;
А - среднее количество колонии образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 пробирках;
1000 - коэффициент, полученный от соотношения 100 мл (общий объем пробы в колбе) к 0,1 мл (объем пробы, использованный для посева).
Например: получен рост микобактерий в первой пробе - 50 КОЕ, во 2-ой - 110 КОЕ, в 3-ей - 98 КОЕ, в 4-ой - 150 КОЕ, в 5-ой - 100 КОЕ, тогда
среднее количество колонне образующих единиц (КОЕ), выросших на 5 пробирках будет равно:
А=(50+110+98+150+100):5 = 102
X = 102×1000 = 1020000, что соответствует 1 млн. живых микробных клеток на тест-объекте.
Проведение обработки тест-объектов раствором испытуемого ДС и контроль эффективности обеззараживания.
Стерильным пинцетом погружают необходимое для проведения эксперимента количество контаминированных тест-штаммом микобактерий тест-объектов в пробирку или чашку Петри с раствором ДС (объем ДС должен рассчитываться с учетом соотношения 1,0 мл раствора на 1 тест-объект), обеспечивая полное смачивание (погружение) тест-объектов, фиксируют время начала экспозиции и следят за соблюдением температурного режима (20±20С).
По истечении заданного времени экспозиции, стерильным пинцетом извлекают тест-объект из раствора ДС и погружают его на 1-2 мин в пробирку со стерильным раствором нейтрализатора при температуре 20±20С (пробирку с раствором нейтрализатора и погруженным в него тестом не встряхивают).
Затем при помощи пинцета размещают тест-объект на скошенную поверхность питательной среды Левенштейна-Йенсена или «Новая» (на скошенную площадку питательной среды в пробирке можно разместить 3 тест-объекта, что позволяет увеличить без дополнительных затрат количество проб на каждую экспозицию, а значит, и достоверность результатов оценки эффективности средства). Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, помещают в термостат в наклонном положении под углом 30º таким образом, чтобы стекающий с теста посевной материал тоже равномерно распределился по поверхности питательной среды, и инкубируют при 370С в течение 10-14 дней с ежедневным просмотром.
Учет и анализ результатов эксперимента
Учет результатов посевов проводят визуально путем подсчета выросших колоний на самом тест-объекте и на поверхности питательной среды. Колонии M. terrae на среде Левенштейна-Йенсена представляют собой шероховатые и матовые выпуклые округлые образования, на среде «Новая» - гладкие и блестящие или с молочным или желтоватым оттенком.
Наличие роста колоний тест-микобактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды показывает, что тестируемое ДС в данном режиме применения (концентрация раствора и экспозиция воздействия) не обеспечивает надежного туберкулоцидного эффекта.
Отсутствие роста колоний тест-микобактерий на тест-объекте и на поверхности питательной среды свидетельствует о наличии у средства в данном режиме (концентрация раствора и экспозиция воздействия) туберкулоцидной эффективности, отвечающей предъявляемым требованиям к ДС для практического их использования (обеспечение снижения уровня обсемененности объекта на 105 КОЕ/см2).
Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие в посевах соответствующих им проб жизнеспособных микобактерий.
Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляется отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.