Средство, растворы которого обеспечивают при температуре 20±20С в течение 60 минут полную гибель микобактерий тест-микроорганизма, может рассматриваться как перспективное туберкулоцидное ДС для дальнейшего изучения: оценки факторов, влияющих на туберкулоцидную активность ДС, отработки режимов эффективного применения и др.
5.3. Методы изучения факторов, влияющих на туберкулоцидную активность дезинфицирующих средств и их субстанций
Для определения условий применения и направлений дальнейших исследований необходимо изучить зависимость туберкулоцидного действия от температуры раствора ДС, величины pH и присутствия белковых загрязнений.
Исследования проводят методом батистовых тест-объектов (п.5.2.).
На основании полученных данных определяют целесообразность и направления дальнейших исследований препарата для применения в качестве ДС.
Определение влияния температуры на туберкулоцидную активность ДС и их субстанций проводят с целью выявления возможности использования подогретых растворов ДС для сокращения времени обеззараживания объектов в отношении микобактерий туберкулеза, а также для оценки эффективности туберкулоцидных свойств при пониженных температурах окружающей среды, обеззараживаемого объекта и самого раствора ДС.
Для изучения влияния температуры рабочие растворы испытуемых ДС готовят в день опыта, наливают в стеклянные колбы (пробирки) из расчета по 0,5 мл на каждый тест-объект.
Исследование влияния положительных температур раствора ДС на его туберкулоцидную активность проводят с использованием водяной бани, в которой нагревают емкость с дезинфицирующим раствором до 18±10С, 37±10С, 55±10С, после чего погружают в него зараженные тест-объекты и поддерживают эти температуры в процессе всего опыта.
Опыты по оценке влияния пониженной температуры на активность ДС проводят с использованием криостата или солевых низкозамерзающих растворов, в которых охлаждают емкость с дезинфицирующим раствором до 10±10С, 5±10С, минус 2±10С и поддержания их в процессе опыта. После достижения указанной температуры в раствор ДС погружают батистовые тест-объекты, контаминированные культурой тест-микроорганизма из расчета 2 тест-объекта на каждую экспозицию.
Через определенные промежутки времени из каждой колбы извлекают по 2 тест-объекта и помещают их при температуре 20±10С в пробирки с соответствующим нейтрализатором на 5 минут, затем во вторую пробирку со стерильной водой на 5 минут и только после этого каждый тест-объект переносят в пробирку со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или «Новая» и укладывают его на поверхность среды. Посевы инкубируют в течение 48-72 ч при 37±10С. Контролем служат по 2 тест-объекта при каждой исследованной температуре, не подвергавшиеся действию испытуемого ДС, но погруженные в пробирки со стерильной водопроводной (питьевой) водой на срок, равный действию испытуемого ДС.
Определение влияния величины pH на туберкулоцидную активность ДС и их субстанций начинают с приготовления рабочих растворов ДС, имеющих различную величину pH (5,6-6,0; 7,0; 8,5-9,0). Для подкисления раствора используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания - децинормальный раствор щелочи. В подготовленные растворы погружают контаминированные микобактериями бязевые (батистовые) тест-объекты. Исследование зависимости туберкулоцидной активности ДС и их субстанций от величины pH проводят по методике, описанной выше, только при нейтрализации действия действующих веществ одновременно понижают или повышают и величину pH, добавляя соответственно кислоту или щелочь.
Определение влияния белковых загрязнений на туберкулоцидную активность ДС проводят с целью выявления возможности влияния (или установления его отсутствия) белковых загрязнений на обеззараживаемом объекте на туберкулоцидную активность ДС.
Исследование проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.2.), только для контаминации тест-объектов используют суспензию тест-микобактерий, содержащую 20,0% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови, которые добавляют в суспензию при ее приготовлении. Инактивацию нормальной сыворотки крупного рогатого скота проводят дробным трехкратным прогреванием на водяной бане при температуре 60±10С в течение 30 минут. Если активность препарата не снижается в присутствии 20,0% белка, концентрацию инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови в суспензии тест-микроорганизма увеличивают до 40,0%. Отсутствие снижения туберкулоцидной активности ДС при добавлении 40,0% сыворотки позволяет считать ДС не реагирующим на присутствие белковых загрязнений.
6. Методы изучения туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания объектов внешней среды Многообразие факторов передачи туберкулеза и длительная выживаемость возбудителей туберкулеза и микобактериозов во внешней среде обосновывает необходимость обеззараживания большого перечня объектов, которые могут быть контаминированы возбудителями в инфекционном очаге на дому, в лечебно-профилактических учреждениях, в специализированных бактериологических лабораториях, работающих с этими возбудителями.
Учитывая вышесказанное, перечень тест-объектов, моделирующих объекты, подлежащие дезинфекции, включает: поверхности помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и др.; изделия медицинского назначения, в т.ч. эндоскопы; предметы ухода за больными, игрушки; посуду, включая лабораторную и из-под выделений; белье, одежду, спецодежду и другие объекты из тканей; изделия из резины, в т.ч. перчатки, сапоги, фартуки и др.; обувь; руки в резиновых перчатках; остатки пищи; выделения: фекалии, мочу, кровь, мокроту; воду; воздух; медицинские отходы.
6.1. Исследование туберкулоцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания поверхностей помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и других объектов
В исследованиях используют тест-поверхности (10×10 см) из различных материалов: дерева (неокрашенного, окрашенного масляной, клеевой или другими красками, оклеенного обоями), линолеума, пластика, кафеля, фаянса, плитки, металлов, стекла.
Тест-поверхности из различных материалов (за исключением деревянных тест-поверхностей, окрашенных клеевой краской и оклеенных обоями) тщательно моют водой с мылом и щеткой, стерилизуют в паровом стерилизаторе (при температуре 121±10С в течение 30 минут). Тест-поверхности, окрашенные клеевой краской и оклеенные обоями, протирают несколько раз стерильной марлевой салфеткой, увлажненной стерильной питьевой водой. Готовят суспензию тест-микобактерий, содержащую 2,0∙109 КОЕ/мл. При разработке режимов обеззараживания раковин, ванн и других загрязненных объектов для имитации органического загрязнения к суспензии добавляют 40,0% лошадиной сыворотки, инактивированной при 560С в течение 30 минут (к 6 мл 2-х миллиардной суспензии прибавляют 4 мл сыворотки).
После подсыхания тест-поверхности располагают горизонтально и на них с помощью одноканального механического дозатора или стеклянной пипетки наносят 0,5 мл суспензии тест-микроорганизма. Суспензию равномерно распределяют по тест-поверхности (100 см2) стерильным стеклянным шпателем. Если суспензия тест-микроорганизма не распределяется равномерно, а собирается в каплю, растирание шпателем по тест-поверхности осуществляют неоднократно (3-5 раз). Контаминированные тест-поверхности подсушивают при комнатной температуре до полного высыхания (30-120 минут). Обеззараживание тест-поверхностей осуществляют способами протирания, орошения или мытья дезинфицирующим раствором.
При обеззараживании тест-поверхности из дерева (окрашенные клеевой и другими красками, оклеенные обоями), из стекла, кафеля и др. располагают вертикально; поверхности из линолеума, метлахской плитки и других покрытий для пола располагают горизонтально. Тест-поверхности обеззараживают путем их орошения, протирания (однократного или двукратного) дезинфицирующим раствором.
В зависимости от вида обрабатываемой поверхности и наличия загрязнений на ней, норма расхода ДС на одну обработку способом протирания составляет 100-150 мл на м2 (1-1,5 мл на 100 см2); способом орошения – 150 мл на м2 (1,5 мл на 100 см2) при обработке распылителем типа «Квазар» и 300мл на м2 (3 мл на 100 см2) – при обработке распылителем типа «Автомакс» или гидропультом.
При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 5-15 минут.
Для контроля эффективности обеззараживания через определенные промежутки времени (15-30-60 и т.д. до 120 минут) с тест-поверхностей делают смывы путем тщательного протирания поверхности стерильной марлевой салфеткой (5см2), увлажненной нейтрализатором. После протирания на тест-поверхности не должно оставаться излишней влаги. Салфетки погружают на 5 минут в пробирки (емкости) с соответствующим нейтрализатором (10 мл), а затем в стерильную питьевую воду с бусами и встряхивают на шейкере в течение 10 мин. Полученную смывную жидкость вносят по 0,1 мл в 3-5 пробирок со скошенной плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена или «Новая», тщательно распределяя ее по всей поверхности. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37±10С в течение 10-21 суток.
В контрольных опытах для обработки аналогично контаминированных тест-поверхностей вместо раствора ДС используют стерильную питьевую воду из того же расчета, что и опытные. Жидкость, в которую помещают стерильную марлевую салфетку после взятия смыва с контрольных поверхностей, перед посевом разводят в 100 раз и вносят по 0,1 мл на скошенную поверхность плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена или «Новая» 3-5 пробирок. Посевы инкубируют в термостате при температуре (37±1) 0С. Учитывают результаты через 10-21 суток.