Отчет 22 с., 4 ч., 9 рис., 1 табл., 11 источников, 0 прил.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА - симбиотическая азотфиксация, растительно-микробные взаимодействия, клубеньковые бактерии козлятника, козлятник восточный, козлятник лекарственный, популяционное разнообразие, симбиотические гены.
Объектом исследования являлась уникальная коллекция растений рода Galega (G. orientalis и G. оfficinalis) и их микросимбионтов - природных штаммов Rhizobium galegae (R. galegae bv. orientalis и R. galegae bv. officinalis), которые были собраны на Северном Кавказе – в одном из генетических центров происхождения козлятника.
Цель проекта заключается в изучении генетических детерминант, вовлеченных в контроль формирования азотфиксирующего симбиоза между клубеньковыми бактериями козлятника (Rhizobium galegae) и их растениями-хозяевами (род Galega).
В связи с поставленной целью сформулированы следующие задачи:
1) провести анализ генетического разнообразия природных популяций двух биоваров клубеньковых бактерий козлятника (R. galegae bv. orientalis и R. galegae bv. officinalis) и их макросимбионтов – природных популяций двух видов растений козлятника G. orientalis и G. officinalis;
2) выявить гены, контролирующие образование клубеньков и симбиотическую фиксацию азота у двух биоваров клубеньковых бактерий R. galegae;
3) выявить гены, контролирующие ранние стадии образования клубеньков для двух видов растений козлятника.
В нашем распоряжении имелась уникальная коллекция природных штаммов Rhizobium galegae, и растений рода Galega, которые были собраны на Северном Кавказе – в одном из генетических центров происхождения козлятника. С использованием методов AFLP и RAPD было проведено сравнение и анализ геномных фингерпринтов растительных и бактериальных популяций, что позволило оценить биоразнообразие данной коллекции. Было обнаружено, что макро- и микросимбионты, относящиеся к виду и биовару orientalis имеют намного большее разнообразие, чем представители второго вида и биовара – officinalis.
В рамках проекта был проведено выявление растительных и бактериальных генов, контролирующих становление бобово-ризобиального взаимодействия. Так, во первых, был проведен молекулярно-биологический анализ участков геномов двух биоваров растений козлятника (G. orientalis и G. оfficinalis), содержащие симбиотические гены NFR5 (продукт гена – протеинкиназа, являющаяся одним из основных рецепторов ризобиального Nod-фактора) и NORK (продукт гена - протеинкиназа, которая принимает участие в “узнавании” растением-хозяином своего микросимбионта и последующем молекулярном сигналинге). Наибольшие различия между генотипами бобовых растений были обнаружены для участков геномов, кодирующих экстраклеточные участки протеинов NFR5 и NORK.
Во вторых, был проведен детальный молекулярно-биологический анализ генов, контролирующих образование клубеньков у одного из биоваров клубеньковых бактерий козлятника - Rhizobium galegae bv. оfficinalis. В общей сложности было выявлено 11 nod-генов (представители семейства генов, ответственных за образование клубеньков на корнях растений-хозяев). Восемь из них (nodABCDIJ и nodEF) тесно сцеплены и организованы в два оперона, еще три – nodU, nodN и nodD2 расположен отдельно на значительном расстоянии (около 40 т.п.н.).
На следующем этапе был проведен молекулярно-биологический анализ участков симбиотических генов NFR5 и NORK для 22-х растений козлятника. Анализ нуклеотидных последовательностей также показал, что растения, принадлежащие к виду Galega orientalis имеют значительно большее генетическое разнообразие, нежели растения G. orientalis. Аналогичные изучение генетического разнообразия было проведено и для участков бактериальных геномов, содержащих регуляторные последовательности для nod-генов у 17-ти штаммов клубеньковых бактерий козлятника. Выявлено согласованное генетическое разнообразие nod-генов микросимбионта с разнообразием рецепторных участков симбиотических генов растения-хозяна. Таким образом, анализ генетического разнообразия на уровне отдельных генов, играющих важную роль в становлении бобово-ризобиального симбиоза, полностью подтвердил полученные ранее данные по генетическому разнообразию на уровне целых геномов.
Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, о процессах эволюционной коадаптации в популяциях макро- и микросимбионтов и, во-вторых, о том, что коадаптация симбионтов, вероятно, связана с изменениями в определенных симбиотических участках генома клубеньковых бактерий и их растений-хозяев. Обнаруженная прямая корреляция между генетическим разнообразием природных популяций клубеньковых бактерий козлятника и генетическим разнообразием их растений-хозяев, принимающих участие в становлении симбиотического взаимодействия, что указывает на одновременную коадаптацию микро- и макро-симбионтов друг к другу.
По результатам проведенных исследований подготовлены к печати две научные статьи. Таким образом, работа по данному проекту была проведена в полном соответствии с утвержденным ранее планом.
Следует отметить, что работе был применен принципиально новый подход, заключающийся в одновременном изучении бактериальных и растительных симбиотических генов с использованием наиболее современных методов молекулярной биологии и полученные результаты могут дать принципиально новые знания о генетических механизмах коадаптации, сопряженной эволюции макро- и микросимбионтов и значительно расширяют наши представления о молекулярно-генетических механизмах становления растительно-микробных симбиозов