«использование ит в исследованиях биофизических свойств клеток крови» (стр. 2 из 5)
На поверхности нейтрофилов экспрессировано значительное количество углеводных структур, которые входят в состав мембранных гликорецепторов и легко выявляются на основании связывания клеток с лектинами. Лектины представляют собой белки неиммунной природы, обладающие свойством обратимо и избирательно связывать углеводные компоненты различных типов гликоконьюгатов, и являются активными стимуляторами функциональных свойств нейтрофилов.
Несмотря на то, что взаимосвязь функциональных свойств нейтрофилов и изменения липидного состава клеточных мембран не вызывает сомнений, данная проблема изучена недостаточно. Исследование роли холестерина в реализации функциональных свойств нейтрофилов при действии лектинов важно не только для понимания механизмов передачи сигналов, но и является ценным для выявления принципиально новых подходов профилактики и лечения социально-значимых заболеваний, связанных с развитием воспалительной реакции и окислительного стресса.
Методики исследования, использованные в данной работе, достаточно хорошо описаны в литературе. Флуоресцентная спектроскопия является хорошо изученным методом исследования биосистем. Теоретические основы флуоресцентной спектроскопии молекул вошли в книгу известного спектроскописта Дж. Лаковича [1]. Флуоресцентная спектроскопия дает информацию о физико-химических свойствах среды, таких как строение молекул, природа химических связей, межмолекулярные взаимодействия, позволяет определить качественно и количественно состав среды. Созданные на основе флуоресцентной спектроскопии, флуориметрические методы анализа позволяют получать информацию о концентрациях веществ в исследуемом образце и оценивать кинетические характеристики химических реакций.
Обработка полученных данных требует специализированного знания программных пакетов обработки, поскольку программное обеспечение, поступающее в комплекте с приборами, зачастую не позволяет осуществить надлежащий и полный анализ получаемых экспериментальных данных.
Так, определение характеристических параметров, численную и статистическую обработку полученных данных, а также графическое представление имеющихся данных (а также последующее оформление их для публикации) удобно производить с использованием следующих программных средств: Microsoft Office Excel, Origin, Mathematica, MatLab и Microsoft Office Word. В данной работе рассмотрим обработку данных с использованием Origin.
1.2 Origin®
Origin – пакет программ фирмы Origin Lab Corporation, предназначенный для численного анализа данных и научной графики, работающий под операционной системой Microsoft Windows. В целом Origin ориентирован на исследователя, которому необходимо обрабатывать и визуализировать большие объемы информации (например, данные, получаемые с различных датчиков и т.п.).
Origin поддерживает создание двухмерной и трехмерной графики при помощи готовых шаблонов, доступных для редактирования пользователем. Также возможно создавать новые собственные шаблоны. После создания изображения оно может быть отредактировано с помощью меню и диалогов, вызываемых двойным щелчком мыши на его элементах.
Полученные графики и таблицы можно экспортировать в ряд форматов, таких как PDF, WMF, TIFF, GIF, GPEG и д.р. Кроме того, графические данные, полученные с помощью Origin, можно легко вставить в документы Microsoft Word, CorelDraw, PowerPoint. Импорт данных – еще одна сильная сторона Origin. Доступен не только импорт ASCII-файлов, но и поддержка формата *.xls (формат табличного редактора Microsoft Excel) и других форматов.
Существенным преимуществом программы Origin является то, что для построения графиков сложных функций не требуется навыков программирования, так как интуитивно понятный интерфейс Origin позволяет легко запрограммировать функцию на языке, максимально приближенном к обычной математической записи и выбрать нужный тип графика.
Общая схема построения графиков такова: пользователь выделяет нужные данные, представленные в таблице, выбирает один из десятков типов предлагаемых двух- и трехмерных диаграмм, и система строит диаграмму или график. Настройка диаграмм выполняется в основном в диалоговых окнах, связанных со строящимся объектом.
В пакете Origin есть много возможностей оформления построенных графиков. Существует возможность выбора стиля, толщины, а также цвета линии. Редактирование осей позволяет выбирать начальное и конечное значения шкалы, шаг, с которым на данной шкале будут отображаться численные величины. Можно отобразить на графике невидимые по умолчанию верхнюю и правую шкалы. Кроме всего прочего, возможно также изменение цвета, размера, шрифта и стиля заголовков осей, задание параметров самих осей, а именно, толщины, длины, направления рисок и т.п. Кроме заголовков осей, выбор соответствующей функции позволяет вносить различные текстовые вставки, подписи для графиков и т.п.
С помощью Origin можно проводить численный анализ данных, включая различные статистические операции, обработку сигналов и т.п. Как и Excel, Origin позволяет совершать операции над столбцами таблицы (нормировка и т.п.). Доступна обработка данных с использованием различных стандартных функций или, при необходимости, с использованием функций, создаваемых пользователем [2]. Можно воспользоваться функциями линейного или полиномиального приближения. Помимо их в Origin имеется большой выбор функций (экспонента, уравнение Больцмана и т.п.), служащих для аппроксимации вводимых данных [2].
Origin позволяет проводить различные статистические исследования экспериментальных данных, такие как нахождение среднего и среднеквадратичного отклонения, поиск минимумов и максимумов и т.п. Origin также может сортировать данные отдельных столбцов, нескольких выделенных столбцов, выделенного диапазона рабочего листа или всего рабочего лист (например, по возрастанию, убыванию).
С помощью встроенной функции Screen Reeder можно с высокой точностью определить координаты любой точки графика.
Кроме всего прочего, предоставленная Origin возможность одновременного представления данных различных проектов на одном рисунке с использованием нескольких слоев существенно облегчает сравнительный анализ данных.
Описанные возможности – лишь часть имеющихся в Origin функций. Однако и их в большинстве случаев вполне достаточно для быстрой и удобной обработки экспериментально полученных данных.
2.1 Объекты и материалы исследования
В работе были использованы метил-b-циклодекстрин (MbCD), b-циклодекстрин (bCD), Тритон Х-100, N-формил-Met-Leu-Phe (fMLP) были получены от фирмы “Sigma”(США), N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc), декстран Т70 фирмы «Roth» (Германия); скополетин, пероксидаза хрена, азид натрия, лимфопреп фирмы “Nycomed” (Норвегия); лектины фирмы НПК Лектинотест (Львов, Украина): Triticum aestivum L. (WGA), Urtica diooca L. (UDA), Glycine hispida L. (SBA), Canavalia ensiformis L. (ConA), Leucojum vernum L. (LVA), Arachis hypogaea L. (PNA), Caragana arborescens L. (CABA), Viscum Album L. (VAA), Phaseolus vulgaris L. (PHA-E/-L), Vicia sativa L. (VSA), Sambucus nigra L. (SNA).
2.2 Методика выделения нейтрофилов
Донорскую кровь, стабилизированную 3,8%-ным раствором цитрата натрия, получали из Республиканской станции переливания крови МЗ РБ. Нейтрофилы выделяли из 20 мл донорской крови. Кровь смешивали с 6% раствором декстрана Т70 в соотношении 5:1 и осаждали клеточную массу в течение 30-40 мин при комнатной температуре с использованием пластиковых шприцов. Слой обогащенной лейкоцитами плазмы собирали в пробирки и центрифугировали в течение 8 мин при 1500 об/мин с использованием лабораторной центрифуги ОПН-3, после этого примесь эритроцитов удаляли гипотоническим лизисом. К осадку клеток добавляли 3 мл охлажденных 0,2% NaCl, затем 3 мл 1,6% NaCl и 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), не содержащего Mg2+ и Ca2+ (pH 7,3; 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl: 10 мМ Na2HPO4 / KH2PO4) и аккуратно перемешивали. Полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин. Осадок клеток ресуспендировали в 6 мл PBS и наслаивали на 3 мл лимфопрепа. Центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Полученный осадок нейтрофилов отмывали в буфере PBS в течение 6 мин при 1500 об/мин. Отмытые нейтрофилы суспендировали в PBS и хранили при 4°С в течение нескольких часов.
2.3 Экстракция холестерина из плазматической мембраны нейтрофилов и его количественное определение
Для экстрагирования холестерина из плазматической мембраны нейтрофилов были использованы циклодекстрины двух видов – МbCD и bCD. Для анализа действия циклодекстринов на нейтрофилы и подбора оптимальных условий эксперимента по экстракции холестерина были протестированы различные концентрации данных веществ при варьировании их времен инкубирования с клетками.
Выделенные нейтрофилы инкубировали при 37°С в отсутствие (контроль) или в присутствие 10 мМ раствора МβCD или 15 мМ βCD в течение 5, 10, 20 или 30 мин. Затем каждую пробу центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Содержание холестерина в полученных супернатантах нейтрофилов определяли спектрофотометрически с использованием соответствующего набора фирмы Анализ-Х (Минск, Беларусь) по интенсивности окраски исследуемой пробы. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию холестерина в ней.
Содержание холестерина в исследуемой пробе рассчитывали как процент от общего содержания холестерина в клетках, лизированных под действием 0,1% Тритона Х-100 (рисунок 2.1).
Рисунок 2.1 – Выход холестерина из нейтрофилов, обработанных 15 мМ bCD и 10мМ MbCD