Ключевые слова: Точность репликации, мутагенез, предшественники ДНК, аналоги азотистых оснований, интзинтрифосфат пирофосфатаза.
Присутствие неканонических аналогов оснований в пуле природных предшественников ДНК снижает точность репликации ДНК. Мутагенные аналоги оснований могут быть причиной наследственных и онкологических заболеваний, что определяет актуальность детального исследования механизмов мутагенеза при действии аналогов. Простейшие эукариотические организмы – дрожжи S. cerevisiae являются удобной моделью для изучения механизмов мутагенеза, индуцированного аналогами оснований. Целью данной работы стало выявление генов, потенциально способных контролировать чувствительность к мутагенному аналогу ГАП, с использованием дрожжевой модели. В рамках цели исследования, были поставлены следующие задачи:
1) Клонировать человеческий ген ITPA в челночном векторе pESC для экспрессии указанного гена в клетках дрожжейгена,
2) Получить мутантные аллели человеческого гена ITPA,
3) Изучить эффекты экспрессии человеского гена ITPA дикого типа и его мутантных аллелей, в клетках дрожжей S. cerevisiae.
4) Очистить человеческий белок ITPA дикого типа и мутантные формы белка.
5) Проверить субстратную специфичность и активность очищенных белков.
В работе использовались методы классической генетики дрожжей, методы молекулярной генетики и биохимии, а именно: трансформация клеток дрожжей и бактерий, метод селективных сред, ПЦР,электрофореза белков и ДНК, рестрикции и легирования ДНК, метод сайт-направленного иутагенеза, методы жидкостной и тонкослойной хромотографии и другие методы.
Частично или полностью были выполнены все поставленные задачи. Получены вектора экспрессии pET15b, несущие ген ITPA и его мутантные аллели N16Q, N16T, P32T, E44L, F149A, W151A, D152A, K172A, H177A и R178A. Очищены соответствующие белки. Начаты работы по исследованию их ферментативной активности и по изучению эффектов экспрессии данных белков в клетках дрожжей. Полученные результаты имеют значение для понимания механизмов поддержания качественного и количественного состава пула предшественников ДНК.