Характеристика Mg2 -залежної Сa2 -активованої ATPази плазматичних мембран (стр. 2 из 3)

В 1988 році була висунута гіпотеза про існування декількох ізоформ Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран при співставленні даних про первинну структуру ферменту, отриманих за допомогою методів генної інженерії та білкової хімії. Було показано, що Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран тератокарциноми людини (hPMCA 1) відрізняється за будовою від Са²⁺, Mg²⁺- АТРази мембран еритроцитів людини. З 184 амінокислотних залишків, що входять до складу структурно охарактеризованих пептидних фрагментів Са²⁺, Mg²⁺- АТРази еритроцитів, лише 158 залишків були ідентичні відповідним амінокислотним залишкам Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран тератокарциноми .

Пызныше Шал та Гріб описали три різні ізоформи Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран з бібліотеки сДНК мозку щурів: rPMCA 1 та rPMCA 2 (rPMCA 3). Всі три ізоформи кодувались окремими генами. Одна з ізоформ Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин мозку щурів (rPMCA 1) складалась з 1176 амінокислотних залишків та мала молекулярну вагу 129500 Да. Її перші 1117 амінокислотних залишків на 99 % були ідентичні трохи раніше описаній ізоформі Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран тератокарциноми прямої кишки людини (hPMCA 1). Аналіз амінокислотних послідовностей дозволив зробити висновок про те, що обидві ізоформи є продуктами одного гену, а розбіжності в структурі С-кінцевих послідовностей є результатом альтернативного сплайсингу відповідних мРНК. Аналогічно було доведено, що ізоформи hPMCA 2 тератокарциноми прямої кишки людини та rPMCA 2 клітин мозку щурів та відповідні ізоформи hPMCA 3 клітин слизової оболонки кишечнику та rPMCA 3 клітин мозку щурів також є продуктами експресії окремих структурних генів.

Слід зазначити, що при скринингу бібліотеки сДНК з мозку бика були знайдені фрагменти структурного гену ще однієї ізоформи Са²⁺, Mg²⁺- АТРази. ЇЇ структура досить істотно відрізняється від структури раніше описаних ізоформ, що є підстави говорити про існування четвертого структурного гену Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран.

За допомогою Northern blot аналізу було доведено, що експресія PMCA 1-4 генів є органозалежною: так, продукти транскрипції гену PMCA 1 характеризуються найширшою розповсюдженістю та представляють головну репрезентативну ізоформу Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран. PMCA 2 ізоформа Са²⁺, Mg²⁺- АТРази переважно виявляється в плазматичних мембранах клітин мозку, серця та печінки, PMCA 3 – в плазматичних мембранах клітин мозку та скелетних м’язів. PMCA 4 ізоформа може бути експресована в еритроцитах та інтестінальних клітинах.

Як вже було зазначено вище, первинні транскрипти кожного з генів можуть піддаватись альтернативному сплайсингу на 3’-кінці нуклеотидної послідовності. Існування великої різноманітності білкових продуктів гену PMCA 1 пояснюється виключенням, включенням або частковим включенням 3’-кінцевого екзону у нуклеотидну послідовність мРНК під час її дозрівання. Процес альтернативного сплайсингу може захоплювати ділянки РНК , які кодують функціонально важливі регуляторні центри ферменту, що знаходяться на С-кінці його поліпептидної послідовності. Зміна в структурній будові цих фрагментів є логічним поясненням існування форм Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз, що відрізняються за чутливістю до кальмодуліну, ванадату, процесів фосфорилювання та ін.

Отже, існування різноманітних за своїми функціональними та регуляторними властивостями форм Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз плазматичних мембран пояснюється багаточисельністю кодуючих генів Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз та існування можливості альтернативного сплайсингу РНК матриць одного й того ж структурного гену. Однак досить логічного пояснення явищу поліморфізму для Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз плазматичних мембран, їх тканинної специфічності, розбіжності в їх функціональних та регуляторних властивостях поки що не знайдено.

Каталітичні та кінетичні властивості очищеного ферменту.

Са²⁺-транспортуюча АТРаза працює на підтримання концентрації іонів Са²⁺ на рівні 10^-8 – 10^-7 М. Відповідно цей фермент характеризується дуже високою спорідненістю до субстрату переносу. Очищена Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран кардіоміоцитів мала К_0,5 по Са²⁺ у присутності кальмодуліну 0,4 мкМ, без кальмодуліну спорідненість зменшувалась: К_0,5 по Са²⁺ становила 20 мкМ. Для ферменту, отриманого з клітин інших типів (гладенькі м’язи шлунку, міометрію, клітини аорти) К_0,5 за відсутності кальмодуліну аналогічно зменшувалась більш ніж на порядок.

На ферменті з мембран еритроцитів було виявлено, що уявна спорідненість ферменту до Са²⁺ значно збільшувалась у присутності кальмодуліну при високій концентрації Mg²⁺ і менш реагувала на кальмодулін при низькій концентрації цього катіону (менше2 мМ). Найвища уявна спорідненість до Са²⁺ спостерігалась при рН 8,0 в присутності чи у відсутності кальмодуліну і прогресивно зменшувалась при наближенні до рН 6,0.

Уявна спорідненість Са²⁺-транспортуючої АТРази мембран еритроцитів до кальмодуліну є досить високою: К_0,5 по кальмодуліну становила біля 6 нМ незалежно від концентрації Mg²⁺. К_0,5 по кальмодуліну Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран гладеньком’язових клітин шлунку складала 27,0 нМ.

Для очищеного ферменту з мембран еритроцитів показана наявність двох К_М по MgATP: високої спорідненості та низької, що дорівнювали відповідно 7 та 140 мкМ. При мілімолярних концентраціях вільного Mg²⁺, перевищуючих концентрацію АТР, активність ферменту гальмувалась.

Після перевірки в якості субстратів очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин міометрію АТР, GTP, UTP, CTP, було показано, що фермент є строго специфічним відносно субстрату та гідролізує виключно молекулу АТР.

Виявлено, що оптимум рН для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран кардіоміоцитів 7,3, мембран еритроцитів – 7,0 – 7,25. Оптимальним для роботи очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази сарколеми міометрію є рН 7,5 – 8,0, в той час як для мембранної її форми оптимум рН знаходиться в діапазоні 6,4 – 7,0.

Температурний оптимум для очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран еритроцитів спостерігався при 37 – 41 ^ОС, для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин міометрію – при 40 – 45 ^ОС. Підвищення температури до 50 ^ОС призводило до значного зниження активності очищеного ферменту.

Регуляція ферменту внутрішньоклітинними факторами та фізіологічно активними речовинами.

Виконуючи в клітинах роль регуляторної системи концентрації іонів Са²⁺, Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран сама є мішенню для дії великої кількості регуляторів. ЇЇ активність та спорідненість до Са²⁺ можуть значно моделюватися багатьма білковими та небілковими факторами - кальмодуліном, кислими фосфоліпідами плазматичних мембран, двохвалентними іонами, сАМР-залежною протеінкіназою та протеінкіназою С, процесом обмеженого протеолізу.

Регуляція Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран кальмодуліном.Перші відомості про регуляцію Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран кальмодуліном були отримані на початку 70-х років Бондом та Клау. В своїй роботі вченими було показано, що для переведення ферменту з менш активної форми А в більш активну форму В було необхідним додавання до виділених мембран не лише іонів Са²⁺ для моделювання реакції накопичення іонів Са²⁺, а також внутрішньоклітинного вмісту, який, напевно, містив “фактор активації”. Пізніше цей фактор було виділено, охарактеризовано та названо кальмодуліном.

Кальмодулін - це невеликий термостабільний білок, що представлений одним поліпептидним ланцюгом молекулярною вагою 16,7 кДа. Цей білок є дуже консервативним: його амінокислотна послідовність є практично повністю ідентичною в ряду від безхребетних до вищих ссавців та людини. Така еволюційна консервативність є свідоцтвом виключно важливої ролі кальмодуліна як регулятора багатьох ферментних систем живих організмів. На цей час відомо понад два десятки кальмодулінзалежних білків. Вважається, що кальмодулін є універсальним регулятором більшості Са²⁺-залежних ферментів, але лише для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран показана пряма регуляція кальмодуліном її активності через безпосередню взаємодію ферменту та активатора. Взаємодія Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран з кальмодуліном призводить до підвищення спорідненості системи до іонів Са²⁺ (у присутності кальмодуліна К_0,5 для Са²⁺ = 0,5 мкМ, у відсутності - К_М для Са²⁺ = 10 - 20 мкМ) та 10-кратного підвищення швидкості гідролізу АТР та трансмембранного перенесення Са²⁺. Кальмодулінзв’язуючий сегмент Са²⁺, Mg²⁺- АТРази характеризується: 1) наявністю великої кількості позитивно заряджених залишків Arg та Lys та їх переважною локалізацією на N-кінцевій ділянці сегмента; 2) переважанням гідрофобних залишків на С-кінцевій ділянці сегмента; 3) наявністю залишку Trp та трьох залишків Ser відповідно на N- та С-кінцевих ділянках пептида. Сам кальмодулінзв’язуючий сегмент знаходиться, як вже було зазначено вище, в С-кінцевій області ферменту.