Характеристика Mg2 -залежної Сa2 -активованої ATPази плазматичних мембран (стр. 1 из 3)

Національний університет “Києво-Могилянська Академія”

Реферат з курсу основи мембранології

тема:

Характеристика Mg²⁺ -залежної Сa²⁺-активованої ATPази

плазматичних мембран.

Студентки І курсу

МП Біологія

Дудник Ірини

Київ

1999

ПЛАН.

Вступ.1.Структура Mg²⁺,Ca²⁺ - ATPази плазматичнихмембран;

2.Каталітичні та кінетичні властивості очищеного ферменту;

3.Регуляція ферменту внутрішньоклітинними факторами та фізіологічно-активними речовинами. Висновки.

Вступ: функціональна роль Ca²⁺, Mg ²⁺- ATPази плазматичних мембран.

Іони кальцію контролюють багато важливих фізіологічних функцій клітини, таких, як електрохімічне спряження при м’язевому скороченні, проникність мембран для іонів натрію та калію, впливають на роботу іонних насосів, регулюють роботу ферментів. Внутрішньоклітинна концентрація кальцію на чотири порядки нижча від зовнішньоклітинної; такий високий градієнт концентрації досягається завдяки функціонуванню АТР- залежних кальцієвих помп.

Результати досліджень енергозалежних Са²⁺-транспортуючих систем вказують на існування двох типів Са²⁺-помп: це Са²⁺ - помпи ендоплазматичного ретикулуму та плазматичних мембран. Ці системи характеризуються високою спорідненістю до Са²⁺, що відповідає концентрації цього катіона в клітині в незбудженому стані.

Для м’язів з добре розвиненим ендоплазматичним ретикулумом (серцевий, скелетні, гладенькі м’язи великих судин, подвздошної кишки) значну роль в регуляції цитоплазматичної концентрації іонів Са²⁺ може виконувати Са²⁺-помпа саме саркоплазматичного ретикулуму. Але в клітинах гладеньких м’язів ендоплазматичний ретикулум розвинений набагато гірше, ніж в скелетних та серцевих, і для більшості таких клітин величина поверхні ендоплазматичного ретикулуму складає 10 % від поверхні плазматичної мембрани. Тому є підстави вважати, що більш суттєва роль в регуляції внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺ в гладеньком’язовій клітині належить саме Са²⁺-транспортуючій системі плазматичної мембрани.

Тонічне скорочення міометрію визначається базальним потоком іонів Са²⁺, який входить в незбуджені міоцити за фізіологічних умов, і цей вхід компенсується кальцієвою помпою сарколеми.

Таким чином, Са²⁺-помпа плазматичних мембран не тільки контролює процес розслаблення гладенького м’язу, але і забезпечує довготривалий трансмембранний обмін Са²⁺, підтримуючи стаціонарне значення концентрації іонів Са²⁺ в міоцитах на рівні 10^-7- 10^-6 М, компенсуючи повільне базальне дифузійне надходження цього катіону в цитоплазму із зовнішньоклітинного простору і регулюючи міогенний тонус м‘язу.

Структура Ca²⁺, Mg²⁺ - ATPази плазматичних мембран.

Са²⁺-залежна АТР-гідролазна активність вперше була знайдена в плазматичних мембранах еритроцитів Дангемом та Глінном в 1961 році. Через 5 років було продемонстровано Шацманном, що виведення Са²⁺ з еритроцитів супроводжується процесом гідролізу АТР всередині клітини та може відбуватися проти штучно створеного високого градієнта концентрації. Але довгий час після відкриття Са²⁺, Mg²⁺- АТРази еритроцитів проблема Mg²⁺, АТР - залежного транспорту Са²⁺ залишалась мало розробленою, оскільки велись широкі дослідження іншого механізму трансмембранного переносу іонів Са²⁺,- Na⁺-Са²⁺обмінник.

Уявлення про вузьке розповсюдження Са²⁺, Mg²⁺- АТРази були спростовані лише в 1978 році, коли Ді Поло та його співробітники описали АТР-залежний транспорт Са²⁺ крізь плазматичні мембрани типових збудливих клітин - гігантських аксонів кальмара. За короткий час присутність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази була доведена для плазматичних мембран багатьох клітин – скелетних, гладеньких м’язів та серцевих м’язів, клітин залозистих тканин, мозкута клітин. За сучасними даними Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран відноситься до числа найбільш широко розповсюджених ферментних систем та є невід’ємним білковим компонентом плазматичної мембрани клітин еукаріот.

Перші найбільш загальні відомості про будову та функції Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран були отримані при дослідженні ферменту у складі нативної мембрани еритроцитів. Однією з найважливіших характеристик АТР-гідролазної системи є механізм гідролізу АТР. За цією ознакою всі відомі АТРази розділяють на два основних типи. АТРази першого типу (F та V-АТРази) здійснюють реакцію гідролізу АТР шляхом прямого переносу γ-фосфату молекули АТР на молекулу води. Ферменти другого типу – Р-АТРази або Е₁-Е₂-АТРази - під час гідролізу АТР утворюють проміжну фосфорильовану форму ферменту. Вони переносять γ-фосфат молекули АТР на фермент з утворенням ковалентного ацилфосфатного зв’язку з бічною карбоксильною групою амінокислотного залишку білку, а потім шляхом гідролізу цього зв’язку на молекулу води.

Дослідження функціональних властивостей Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран продемонстрували її приналежність до ферментів Е₁-Е₂ типу. При підвищенні концентрації іонів Са²⁺ в цитоплазмі відбувається зв’язування катіонів з ферментом, який знаходиться у формі Е₁-конформації, що характеризується високою спорідненістю до Са²⁺. Відбувається Са²⁺-залежний перенос γ-фосфату молекули АТР на молекулу ферменту та утворення фосфорильованого продукту Е₁-Р. На стадії фосфорильованого ферменту відбувається конформаційна перебудова білка у форму Е₂-Р. На стадії конформеру Е₂-Р спорідненість Са²⁺, Mg²⁺- АТРази до іонів Са²⁺ падає на декілька порядків. Результатом такого конформаційного переходу є вивільнення Са²⁺ у зовнішньоклітинний простір. Завершується реакційний цикл Mg²⁺-залежним дефосфорилюванням Са²⁺, Mg²⁺- АТРази та перетворенням ферменту у форму Е₁ (Рис.1).

Рисунок 1.

Схема реакційного циклу Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран.

Са²⁺

АТР + Е₁ Е₁ - Р + АDР

Р_і + Е₂ Е₂ - Р

Са²⁺

де Е₁, Е₂ - конформаційні форми ферменту,

Р_і - неорганічний фосфат.

Дослідження Са²⁺, Mg²⁺- АТРази у складі нативної плазматичної мембрани дозволило отримати лише найбільш загальні відомості про її структуру та функції. Для більш детального дослідження цих характеристик треба отримувати солюбілізовану форму ферменту.

Доступність солюбілізованої форми даного ферменту надала можливість визначення первинної структури молекули Са²⁺, Mg²⁺- АТРази, що дало змогу остаточного докорінного аналізу всіх його властивостей.

Вперше повна амінокислотна послідовність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин людини була встановлена в 1988 році. Для аналізу нуклеотидної послідовності було використано ген ферменту з сДНК банку тератокарциноми прямої кишки людини. Закодована послідовність складалась з 1220 амінокислотних залишків, що утворюють поліпептид молекулярною вагою 134 683 Да.

В будові ферменту були знайдені великі ділянки структурної подібності з іншими іонтранспортуючими Е₁-Е₂-АТРазами. До таких ділянок відносяться : 1) пептидна ділянка навколо амінокислотного залишку Asp-475, який фосфорилюється під час реакційного циклу; 2) FITC (АТР)- зв’язуюча ділянка; 3) пептидна ділянка, що розміщена між двома попередніми, яка забезпечує їх просторове зближення та ін. Наявність цих гомологічних та висококонсервативних ділянок в структурі Е₁-Е₂-АТРаз, напевно, обумовлено їх участю у найважливіших та загальних для всіх АТРаз етапах функціонування.

Молекула містить 10 трансмембранних сегментів, що з’єднані на зовнішньоклітинній поверхні плазматичної мембрани досить короткими петлями. На внутрішньоклітинному боці плазматичної мембрани фермент утворює якнайменше дві довгі гідрофільні петлі (між другим та третім, четвертим та п’ятим гіфдрофобними сегментами). До складу другої петлі входять АТР-фосфорилюємий та АТР зв’язуючий сегменти каталітичного ферментативного центру. Функціональна роль першої петлі поки що не з’ясована. По аналогії з іншими Е₁-Е₂-АТРазами вона може брати участь у спряженні процесів транслокації катіонів та гідролізу АТР. Слід зазначити, що до складу цієї петлі входить також суто специфічний для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази фрагмент, який напевно є регуляторним центром ферменту, що є чутливим до фосфоліпідів.

В середину клітини також експоновані N- та C - кінцеві ділянки Са²⁺, Mg²⁺- АТРази. Функціональна роль N-кінцевого сегменту остаточно не з’ясована, але наявність в ній великої кількості негативно заряджених амінокислотних залишків дає підстави вважати, що він бере участь у процесі безпосереднього зв’язування з іонами Са²⁺. С-кінцевий сегмент без сумніву є регуляторним, оскільки тут розташовані кальмодулінзв’язуюча аутоінгібіторна ділянка, сегмент регуляторного фосфорилювання ферменту сАМР-залежною протеїнкіназою. Області навколо кальмодулінзв’язуючої ділянки білка також багаті на від’ємно заряджені амінокислотні залишки, що дає підставу розглядати їх в якості центрів зв’язування та транслокації катіонів.