Діагностика хламідіозу проводилася за допомогою комерційних наборів для прямої імунофлюоресценції з специфічними моноклональними антитілами у відповідності з інструкцією (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м.Москва).
Окрім того, для діагностики урогенітального хламідіозу нами були використані наступні методики: 1) фарбування зішкрібів з цервікального каналу по методу Романовського-Гимзе (10% розчином азур-еозину); 2) визначення специфічних IgG і IgM до Chlamydiatrachomatis у сироватці крові пацієнток, використовуючи комерційні набори (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ).
При заборі матеріалу для дослідження необхідною умовою є наявність циліндричних клітин епітелія цервікального каналу, а не вмісту піхви, так як хламідії є внутрішньоклітинними паразитами. Забір матеріалу з цервікального каналу проводився після попередньої обробки піхвової частини шийки матки ватним тампоном, а потім ложечкою Фолькмана з цервікального каналу проводився забір відокремлюваного з його стінок.
Мікроскопічна діагностика трихомоніазу включала дослідження нативного матеріалу на наявність у ньому специфічних рухомих тілець з джгутиками. З цією метою з дотриманням асептики проводили змив теплим розчином Рінгера або ізотонічним розчином натрія хлориду з стінок піхви. Після нетривалого перемішування крапля змиву наносилася на предметне скельце і накривалася покривним скельцем. Вивчення нативного препарату проводилося під медичним світловим мікроскопом з темнопольним конденсором, окуляром 10х і об’єктивом 40х. При виявленні клітин, морфологічно відповідаючих трихомонадам, з джгутиками і відповідним зворотньо-поступальним рухом, виставляли діагноз трихомоніазу. Окрім того для діагностики трихомоніазу використовували виявлення Trichomonasvaginalis у мазках фарбованих 1% водним розчином метиленового синього, по Граму у модифікації Кореloff, по Романовському-Гімзе.
Кінцеве заключення про наявність у досліджуваному матеріалі Trichomonasvaginalis робили тільки на основі виявлення типових простіших (овальні, круглі або неправильної форми, досить чітко виражений контур клітини, частіше ексцентрично розташоване овальне або кругле ядро з нечітким контуром, нерідко “піниста” цитоплазма [2, 3, 95].
Виявлення Neisseriagonorrhoeae проводили у всіх пацієнток на основі мікроскопії мазків, фарбованих 1% водним розчином метиленового синього, по Романовському-Гімзе і по Граму у модифікації Кореloff. Враховуючи тропність гонококів до циліндричного епітелію забір матеріалу проводили з цервікального каналу. Бактеріоскопічна діагностика основана на наявності трьох ознак – характерної морфології, внутрішньоклітинного розташування бактерій і забарвленню по Граму. При підозрі на гонококову інфекцію проводили посіви на асцит-агар для виділення і ідентифікації культури гонококів [2, 3, 95, 283].
Діагностика вагінального кандідозу проводилася за допомогою мікроскопії нативних вологих мазків з 10% розчином гідрооксиду калію (для виявлення псевдо гіфів) і мазків, фарбованих 1% водним розчином метиленового синього, по Граму у модифікації Кореloff. У частини хворих з мікроскопічною картиною кандідозу по показах для підтвердження діагнозу проводили посіви на середовище Сабуро (рідке і агаризоване) [2, 3, 5, 95].
Мікоплазмова інфекція діагностувалася за допомогою комерційних наборів для РПІФ з специфічними моноклональними антитілами у відповідності з інструкцією (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м.Москва). Забір матеріалу проводили ложечкою Фолькмана з верхньої третини бокового склепіння піхви. А також визначали специфічні IgG і IgM до антигенів Mycoplasmahominis у сироватці крові пацієнток за допомогою комерційних наборів (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ). Також використовували “золотий” стандарт для виявлення Mycoplasmahominis виділення збудника у культурі на рідкому живильному середовищі з додаванням аргініну, рекомендованим харківським НДІ дерматології і венерології [2, 3, 95].
Діагностика уреаплазмової інфекції проводилася наступними методами. Виявлення специфічних антигенів Ureaplasmaurealyticum РПІФ з специфічними моноклональними сироватками, використовуючи комерційний набір (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м. Москва). Матеріал для мазків відбирали з верхньої третини бокового склепіння піхви. Для виявлення IgG до антигенів Ureaplasmaurealyticum у сироватці крові пацієнток методом ІФА використовували комерційні набори (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ). Також використовували “золотий” стандарт для виявлення Ureaplasmaurealyticum виділення збудника у культурі. Для цього використовували рідке живильне середовище з додаванням сечовини рекомендоване Харківським НДІ дерматології і венерології та, в основному, модифіковане середовище з лінкоміцином. Використання культурального дослідження було обов’язковим для верифікації діагнозу уреаплазмової інфекції [3, 95].
У процесі виконання роботи для виключення вірусної етіології захворювання використовувалися скринінгові методи вірусологічної діагностики. Лабораторна діагностика вірусної інфекції була орієнтована перш за все на визначення герпетичних і цитомегаловірусних уражень. Матеріалом для дослідження були мазки, взяті ложечкою Фолькмана з верхньої третини бокової стінки піхви з дотриманням правил асептики. При наявності уражень шкіри у області вульви і промежини у вигляді везикул, кондилом і ерозій для дослідження, використовували вміст везикул і зішкріби з підозрілих на вірусне ураження участків. Одержаний матеріал наносили на три знежирені предметні скельця, висушували на повітрі при кімнатній температурі і фіксували у 96% етиловому спирті або ацетоні упродовж 5 хвилин. Після чого проводили фарбування по Романовському-Гімзе (перший мазок), другий мазок обробляли специфічними моноклональними сироватками для виявлення антигенів Cytomegalovirus, а третій – специфічними моноклональними антитілами для виявлення антигенів HerpessimplexvirusIItype методом РНІФ, використовуючи комерційні набори (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м. Москва). Перший мазок досліджували під медичним світловим мікроскопом з імерсією (окуляр 10х, об’єктив 90х), а два інші під люмінесцентним мікроскопом Мікмед-2, варіант 11 (“Ломо”, м. Санкт-Петербург), використовуючи масляну імерсію (окуляр 7х, об’єктив Мі 90х, з фільтром забезпечуючим збудження світла з довжиною хвилі 490 нм і емісією з довжиною хвилі 520 нм.).
А також для діагностики вірусної інфекції використовували метод ІФА, виявляючи специфічні антитіла у сироватці крові пацієнток – IgM і IgG до антигенів Cytomegalovirus і HerpessimplexvirusIItype, використовуючи комерційні набори для ІФА (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ) [2, 3, 95].
Проби для бактеріологічного дослідження відбирали в асептичних умовах, намагаючись попередити обсіменіння досліджуваних зразків супутньою аутомікрофлорою шкіри і інших локусів, що багато у чому визначало ефективність і достовірність бактеріологічної діагностики. Досліджуючим матеріалом був піхвовий вміст, який одержували під час гінекологічного огляду за допомогою стерильного дзеркала типу Куско або Сімса, використовуючи одноразові стерильні шприци, шпателі, ватні тампони або ложечки Фолькмана. Вказані зразки відбирали до початку лікування, через 7-10 днів після закінчення лікування і через 1 місяць по завершенню лікування.
Критеріями виключення пацієнток з дослідження було системне або місцеве використання антибактеріальних препаратів на протязі останніх двох тижнів (так як антибактеріальна терапія змінює мікробний пейзаж інфекційних вогнищ), вагінальний кандідоз, гонорея, трихомоніаз, хламідіоз, активна герпесвірусна та цитомегаловірусна інфекція.
Посів піхвового вмісту проводили на групу живильних середовищ, які дають можливість виявити максимальну видову різноманітність бактерій з використанням анаеробних технологій.
Система виділення і ідентифікації мікроорганізмів умовно включала два етапи: долабораторний (клінічний) і лабораторний. Долабораторний етап починався з моменту одержання матеріалу і завершувався доставкою проб у мікробіологічну лабораторію. Однією з умов транспортування зразків матеріалу був часовий інтервал, який не мав перевищувати 2-х годин. Для транспортування і накопичування одержаного матеріалу використовували цукровий, глюкозо-пептонний і серцево-мозковий бульйони, тіогліколеве середовище для контролю стерильності.
Всі етапи мікробіологічного дослідження виконувалися на базі бактеріологічної лабораторії об’єднаної клініко-діагностичної лабораторії обласного перинатального центру м. Івано-Франківська і бактеріологічної лабораторії кафедри мікробіології Івано-Франківської державної медичної академії.
Лабораторний етап починався з первинного посіву нативного матеріалу і закінчувався ідентифікацією виділених мікроорганізмів з визначенням у частини штамів антибіотикограм. У середньому для цього потрібно було від 4 до 15 діб.
Первинний висів досліджуваного матеріалу проводили на цукровий агар, 5% кров’яний агар, середовище Ендо, агар МРС, анаеробний гемагар із необхідними для культивування ОАБ добавками (збагачений геміном, менадіоном, твіном-80, гемолізованою кінською або людською кров’ю і вітаміном К). Живильні середовища готували самостійно у лабораторії, використовуючи сухі середовища.
У основу схем і методів ідентифікації всіх виділених культур та таксономічне положення бактерій визначали у відповідності з даними “Bergey’sManualofSystematicBacteriology” [173, 174 , 175].
Окрім того частина штамів стафілококів і стрептококів ідентифікована за допомогою слайд тестів (“Difco», США; “bioMerieux”, Франція), ЛБ за допомогою “Системи індикаторних папірців для ідентифікації лактобацил” (СІП-Л) (Нижньо-Новгородський науково-дослідний інститут епідеміології і мікробіології, Росія).