Двумерная спектроскопия ЯМР (стр. 1 из 2)

Реферат

на тему:

Двумерная спектроскопия ЯМР

Донецк 2008

Введение

Развитие двумерной спектроскопии ЯМР открыло новые возможности для развития разнообразных биологических приложений ЯМР. В принципе каждая серия экспериментов, в которых наряду с интервалом времени детектированияt2варьируется второй параметр, например длительность периода эволюции ti, представляет собой двумерный ЯМР. Примером такого эксперимента является серия одномерных спектров, характеризующих некую химическую реакцию, которые измеряются последовательно через определенный промежуток времени t. Если по одной из осей откладывать значения времени ti, а по другой выписывать спектры, регистрируемые в эти моменты времени, то получим двумерный спектр. Такого рода двумерная спектроскопия известна с момента открытия метода ЯМР.

От 2М-спектроскопии обычно требуется выполнение следующего условия: вторая переменная обязательно должна быть связана со специфическими свойствами исследуемой спиновой системы. В настоящее время развито достаточно большое число методов получения двумерных спектров ЯМР. Эти методы реализованы в виде стандартных процедур – сервисных программ – и получаемые экспериментальные данные могут быть представлены в виде функции двух частотных переменных. Двумерная спектроскопия ЯМР обладает рядом преимуществ по сравнению с одномерными методами: Информация может быть представлена как функция двух переменных. Это позволяет достигнуть достаточно хорошего разрешения в сложных спектрах, например в таких, которые в одномерном случае представляют собой наложение перекрывающихся линий. Двумерные эксперименты позволяют проводить надежное отнесение линий в таких спектрах. Одновременно с этим разделением по двум переменным можно провести выбор соответствующих физических взаимодействий, что обеспечит разделение по двум измерениям. Наконец, в двумерной спектроскопии ЯМР можно достаточно просто наблюдать многоквантовые переходы, которые в первом приближении запрещены правилами отбора по спиновому квантовому числу.

Путем введения других временных переменных можно осуществить переход к n‑мерным спектрам ЯМР. Следует, однако, отметить, что ограничение проведения эксперимента по времени некоторым значением, обычно реализуемым на практике, не позволяет значительно увеличить число временных переменных, так что реально достижимое число переменных – три.

1. Двумерный ЯМР-эксперимент

В настоящее время в двумерной ЯМР-спектроскопии, как правило, используются методы Фурье-спектроскопии. В этом случае проводится детектирование сигнала SUi, t2) из которого путем Фурье-преобразования вычисляется двумерный спектр Sв частотной области. В принципе двумерный ЯМР-спектр можно получить и с использованием альтернативного метода – стохастического метода, однако этот метод находится пока в стадии разработки.

Основной 2М-ЯМР-эксперимент можно схематически представить во временной области, разделив его на следующие 4 фазы: подготовки, эволюции, смешивания и детектирования. На фазе детектирования сигналы, как и в одномерном случае, регистрируются через равные промежутки времени Дt2, затем они подвергаются оцифровке и накапливаются. Фаза подготовки, как правило, состоит из 90°-ного импульса, формирующего поперечную намагниченность. На протяжении фазы эволюции, длительность которой равна t, поперечная компонента намагниченности изменяется. Затем следует период смешивания, который, вообще говоря, в некоторых экспериментах может отсутствовать. Компоненты поперечной намагниченности связаны между собой разнообразными взаимодействиями. На протяжении интервала длительностью tiони подлежат детектированию и преобразованию. Длительность периода tiпостоянно возрастает от эксперимента к эксперименту на величину ДЯй, причем длительность интервала tjопределяется так же, как и интервала t2, теоремой Найквиста. Спектр, соответствующий каждому значению t, накапливается отдельно. Таким образом, строится двумерная матрица, в которой каждой паре значенийсоответствует сигнал амплитудой S – Двумерное Фурье-преобразование превращает сигнал во временной области S. Такое Фурье-преобразование можно записать следующим образом:

Выражение представляет собой следующую цепь операций: сначала все сигналы свободной индукции подвергаются Фурье-преобразованию по переменной t2. Возникающая при этом новая матрица данных содержит в строках спектры ЯМР, соответствующие значениям ti. Затем проводится второе Фурье-преобразование по переменной t\, т.е. данные, приведенные в столбцах, рассматриваются как отдельные сигналы свободной индукции, и они, как обычно, подвергаются Фурье-преобразованию.

Фурье-преобразование имеет действительную и мнимую части. Обычно вычисляют только действительную часть или модуль функции S. Интенсивности в двумерных спектрах имеют вид поверхностей, представленных как график функции двух переменных, т.е. напоминают изображение земной поверхности. Графически двумерные спектры представляют двумя способами. Первое представление – двумерная поверхность – дает наглядную картину 2М-спектра. Второе представление выглядит как географическая карта, на которой линии уровня соответствуют сигналам одинаковой интенсивности. Такое представление обычно используется при обработке двумерных спектров для того, чтобы избежать перекрывания слабых сигналов сильными.

В табл. приведены последовательные этапы обработки данных при построении одномерных спектров. Если попытаться перечислить все варианты двумерной ЯМР-спектроскопии, то это была бы весьма сложная задача, поскольку их более сотни. Однако для биологических приложений используются лишь некоторые из них. Чтобы их упорядочить, прежде всего необходимо подчеркнуть различие между гетероядерной и гомоядерной 2М-спектроскопией. В гомоядерной спектроскопии наблюдается взаимодействие ядер одного сорта, например, протонов. В этом случае двумерная импульсная последовательность состоит из импульсов, воздействующих на спиновую систему на близких частотах. В гетероядерных экспериментах наблюдаются взаи-модействия ядер различных типов, например, Си Н, и в импульсной последовательности содержатся импульсы из различных частотных областей.

Обработка данных при проведении двумерных экспериментов

1. Соответствие ССИ различным значениям инкрементов t₁ в матрице.S.Н й строк матрицы содержат отдельные сигналы свободной индукции W₂ значений

в каждой строке), при этом строки упорядочены в соответствии с ростом времени fj.

2. Цифровая фильтрация всех ССИ: умножение всех строк на соответствующую фильтрующую функцию.

3. Фурье-преобразование всех ССИ, подвергнутых фильтрации; строки матрицы содержат только спектры S.

7. Проведение Фурье-преобразования данных в направлении г1 по столбцам.

8. Коррекция фазы в направлении Я1.

9. Представление 2М-спектров Sи диполь-дипольным.

2. Обнаружение спин-спинового взаимодействия в гомоядерном случае

Как уже отмечалось, косвенное спин-спиновое взаимодействие, характеризуемое константой взаимодействия J, тесно связано с ковалентной химической структурой. Если химическая структура известна, то можно провести отнесение соответствующих резонансных линий. Если же структура неизвестна, то можно выбрать структуру из нескольких альтернативных. В общем случае следует найти ответ на следующие два вопроса: Какие из ядерных спинов связаны между собой взаимодействием? Насколько велико это взаимодействие? В принципе можно получить ответ на оба эти вопроса для достаточно простых структур даже с использованием одномерных методик, например, с помощью развязки или построения теоретических спектров. В более сложном случае, когда в спектрах содержатся перекрывающиеся линии, эти методы приводят к успеху только при использовании большою числа трудоемких и длительных экспериментов. С помощью двумерных методов эту информацию можно получить из одного эксперимента. Стандартным методом при этом является метод COSY, в котором применяются два 90°-ных импульса, разделенных временем эволюцииt1. Полученный спектр симметричен относительно диагонали, на которой расположены так называемые диагональные пики. Эти спектры по содержащейся в них информации соответствуют одномерному спектру. Основная информация содержится в пиках, расположенных вне диагонали - это так называемые кросс-пики. Именно эти пики указывают на то, между какими ядрами существует спин-спиновое взаимодействие, т.е. они позволяют определить те константы спин-спинового взаимодействия, которые превышают ширину линий компонент мультиплетов. Тонкая структура кросс-пиков позволяет получить представление о величине констант спин-спинового взаимодействия.

По спектрам, получаемым по методу COSY, можно достаточно просто установить характер связи. При этом, исходя из какого-либо кросс-пика, находим соответствующий ему кросс-пик по горизонтали и по вертикали. Большинство всех двумерных спектров выглядит так же, как и спектр, полученный по методу COSY. Существует несколько вариантов экспериментов COSY. Основным является эксперимент, позволяющий существенно упростить спектры за счет м-квантовой фильтрации. При этом упрощение спектров может привести к потере информации. Как правило, в основном ограничиваются получением спектров после двух- и трехбайтовой фильтрации, так как с ростом порядка фильтрации неизбежно понижается отношение сигнал/шум. Особую практическую ценность имеет эксперимент, называемый эстафетным COSY‑экспериментом – эстафетный когерентный перенос). В спектре, полученном с использованием этого метода, наряду с обычными COSY‑пиками, наблюдаются сигналы, позволяющие судить о наличии в спиновой системе кроме двух слабо взаимодействующих ядерных спинов еще одного спина, с которым они оба взаимодействуют, причем это взаимодействие достаточно велико.