Зависящие от времени процессы в ядерном магнитном резонансе (стр. 3 из 4)
Существует еще одна возможность пометить спин В. Эта возможность может быть реализована посредством инверсии намагниченности, соответствующей спину В, селективным 180°-ным импульсом. При этом эффект воздействия на состояние спина ядра А может быть обнаружен с помощью неселективного детектирующего импульса, который подается на спиновую систему спустя времяф.В этом эксперименте с ростомфпрежде всего уменьшается интенсивность сигнала от ядра А до значения, соответствующего минимальному, а затем возрастает вновь до величины, соответствующей значению для невозмущенной системы.
Источниками погрешностей, которые могут вызывать неверную интерпретацию результатов, является ограниченная селективность инвертирующих и насыщающих импульсов, которые могут искажать соседние линии, а также вызывать ядерный эффект Оверхаузера, неявным образом влияющий на интенсивность резонансных линий, в частности, на сигнал А.
6. Ядерный эффект Оверхаузера
Изменение интенсивности сигнала в спектрах ЯМР за счет насыщения соответствующих резонансных состояний спина электрона впервые было обнаружено А.В. Оверхаузером. Впоследствии это явление было названо эффектом Оверхаузера. Перенос принципов этого эксперимента на систему двух спинов, связанных между собой диполь-дипольным взаимодействием, является основой для определения пространственной структуры методом ЯМР. Эффект Оверхаузера и ядерный эффект Оверхаузера основаны на изменении поляризации, наблюдающейся в связанной системе при условии изменения населенности одной или нескольких подсистем. Так как диполь-дипольное взаимодействие, определяющее изменение населенностей, зависит от расстояния между взаимодействующими спинами, то величина ЯЭО также зависит от расстояния между ними. Эта зависимость позволяет определить соответствующие межатомные расстояния.
Экспериментальные методы, с помощью которых наблюдается ЯЭО, подобны методам, используемым для определения скоростей обмена в случаях переноса поляризации с насыщением или инвероного переноса поляризации. В данном контексте эти методы известны, как TOEи переходный ЯЭО. Кроме того ЯЭО измеряется в двумерных ЯМР-экспериментах, которые могут быть использованы для определения скоростей химического обмена.
Простейшей системой, позволяющей достаточно наглядно продемонстрировать ЯЭО, является молекула, в которую входят два спина А и В, связанные диполь-дипольным взаимодействием, причем Ia = Ib– 1/2. Если провести усреднение по большому числу таких молекул, то каждой молекуле можно поставить в соответствие 4 возможных состояния, характеризуемых определенными населенностями, т.е. установить, с какой вероятностью населено каждое из состояний. В состоянии термодинамического равновесия имеет место распределение Больцмана. Если нужно изменить населенности, облучая спиновую систему на частоте, соответствующей резонансной частоте ws спина В, то вследствие диполь-дипольного взаимодействия произойдет изменение населенностей всех спиновых состояний. При условии, что облучение проводится в течение длительного времени, в системе установится новое стационарное состояние. Возникающие при этом релаксационные процессы можно в зависимости от изменения суммарного квантового числа m ядер А и В обозначить как нульквантовые, одноквантовые и двухквантовые.
Изменения населенностей приводят также к изменению ж-компоненты
Maнамагниченности спина А, величину которой к моменту времени tможно определить с помощью 90°-ного импульса. После фурье-преобразования найдем изменение интенсивности соответствующей резонансной линии на частоте wA.
Эти изменения намагниченности во времени можно описать с помощью дифференциальных уравнений
В этих уравнениях рА и рвобозначают скорости спин-решеточной релаксации ядер А и В, Oab– скорость релаксации, описывающая обмен между ядрами А и В, M0– намагниченность в состоянии термодинамического равновесия. Скорости релаксации определяются следующим образом:
где W0, W\ и Wi– вероятности нуль-, одно- и двухквантовых переходов, а RaQобозначает дополнительные каналы релаксации для спинов А и В.
Ядерный эффект Оверхаузера измеряется отношением интенсивности сигнала Sпосле возбуждения к интенсивности сигнала S0в отсутствие возбуждения или отношениемMzM0, поскольку интенсивность сигнала пропорциональна величине ж-компоненты намагниченности. Если в течение времени X, которое существенно больше времени продольной релаксации системы, на систему воздействует РЧ импульс на частоте, то это приведет к тому, что в стационарном состоянии MZB, dMz /dtn dMzIdtв и обратятся в нуль. Простым преобразованием и подстановкой для оценки ЯЭО в стационарном состоянии получим
Так как равновесная намагниченность пропорциональна гиромагнитному отношению у, то можно переписать в виде
Вероятности переходов для продольной релаксации даются следующими формулами:
Если движение, влияющее на релаксационные процессы, изотропно, как, например, вращательная диффузия, то коэффициент Qab, который пропорционален интенсивности взаимодействия, имеет вид
гдемп– магнитная проницаемость вакуума, гав – расстояние между спинами AЬВ.
Соответствующая функция спектральной плотности .
. есть 
Если подставить эту функцию в выражение дляси получим максимальное усиление сигнала в 2,988 раза, если проведем насыщение по протону, непосредственно связанному с углеродом. Это увеличение чувствительности является дополнительным, поскольку при измерении спектров ЯМР 13C обычно используется широкополосная развязка. Правда, необходимо помнить, что ЯЭО не всегда приводит к увеличению интенсивности. Ядра 15N и 29Si имеют отрицательное гиромагнитное отношение, и ЯЭО приводит к уменьшению сигнала.
Если внешняя релаксация отлична от нуля, то стационарный ЯЭО зависит от расстояния между спинами, и его можно использовать для определения этого расстояния.
Однако для количественного определения расстояний необходимо дополнительное рассмотрение эффекта с учетом внешней релаксации.
Межатомные расстояния можно определить более точно, если проследить за временной зависимостью ЯЭО. На рис. 2.12 показано влияние переноса поляризации с насыщением между метильной группой и ароматическим кольцом в HPr‑протеине, который является компонентой фосфоенолпируватзависимой системы фосфотрансферазы. Влияние насыщающего импульса, который подается на частоте 0) в, можно лучше всего оценить количественно, если кроме спектра в режиме предварительного насыщения на частоте Шв снять также исходный спектр в режиме предварительного насыщения на частоте Шв, т.е. спектр, в котором резонансная линия на частоте Шв отсутствует. Разностный спектр позволяет селективно оценить эффект Оверхаузера. Величина наблюдаемых эффектов часто может составлять несколько процентов, т.е. относительно мала. Для получения хорошего значения отношения сигнал/шум необходимо провести большое число накоплений. Небольшие нестабильности в работе прибора могут вносить искажения в разностную картину, и часто именно этим объясняется необходимость построения циклического эксперимента, причем попероменно проводится, например, 16 экспериментов в режимах on-resonance и off-resonance, а соответствующие спады свободной индукции накапливаются отдельно. С помощью этого метода можно наблюдать на современном спектрометре ЯЭО величиной в несколько процентов. Если построить зависимость величины
ЯЭО от длительности насыщающего импульса или длительности интерва-ламежду 180°-ным и 90°-ным импульсами, то первоначальное возрастание определится межатомным расстоянием Tabмежду рассматриваемыми спинами. Определение расстояний: с помощью эффекта Оверхаузера является существенным элементом алгоритма установления структуры биологических макромолекул с помощью ЯМР.
7. Использование стабильных изотопов в качестве меток
Введение радиоактивных изотопов в качестве меток – один из стандартных методов, используемых в биохимии для установления путей протекания реакций. В ЯМР он также является основным экспериментальным методом, однако при условии, что используются стабильные изотопы. Если ход химических реакций известен точно, то этот метод может быть использован в качестве вспомогательного для проведения отнесения сигналов в спектрах. Если, например, в определенном положении протон замещается на дейтерий, то отсутствие соответствующей линии в спектре является точным доказательством того, что именно этот протон занимает данное, определенное положение. Для того чтобы иметь возможность проследить за ходом протекания реакций, необходимо заменить изотоп, регистрируемый обычно в спектрах ЯМР, на другой изотоп, и затем проследить за изменением интенсивности соответствующей линии в спектре ЯМР.