Вообще, саморадиолиз соединений, меченных фосфором-32 или фосфором-33, очень неудобное для работы явление, и его надо учитывать. Без радиопротекторов меченные фосфором-32 соединения в концентрированном растворе (более 15 мКи/мл) могут храниться очень недолго, а в сухом виде оставлять их дольше нескольких часов не следует, т.к. скорость химических превращений, под действием ионизирующего излучения в этом случае очень высокая.
Основное отличие фосфора-33 от фосфора-32 заключается в энергии β-излучения этих радионуклидов, т.к. различие в периоде полураспада менее чем в 2 раза несущественно. При этом преимущество более слабого излучения фосфора-33 (кроме психологического комфорта) проявляется только при необходимости авторадиографии с высоким разрешением близко расположенных меченых продуктов, например, автограф геля после электрофоретического разделения меченых фрагментов нуклеиовых кислот. Действительно, эффективность "ручного радиоактивного" сиквенса определялась разрешающей способностью электрофоретического разделения продуктов реакции терминации синтеза ДНК (в методе Сэнгера) или фрагментов химического расщепления [5'-32P]-одноцепочечной ДНК (по Максаму-Гилберту). Для 32Р-меченых фрагментов с одного геля квалифицированный специалист мог "прочитать" 350÷400 нуклеотидов. "Зубры" секвенирования ДНК в Москве и Новосибирске довели эту величину до 700 нуклеотидов. Однажды, автору этого обзора в новосибирском Академгородке с гордостью продемонстрировали автограф геля, с которого удалось "прочитать" почти 750 нуклеотидов. В научном фольклоре встречались даже более высокие величины (вплоть до 1000), однако, таких задокументированных результатов я не встречал. Переход на фосфор-33 только за счет более мягкого β-излучения сразу увеличивал разрешение в 1,5÷2 раза и, следовательно, повышал производительность труда при сиквенировании ДНК. Впрочем, автоматические секвенаторы ДНК, использующие флюоресцентную метку, полностью прекратили эту гонку за производительностью "ручного сиквенса" с использованием радиоактивных изотопов.
9. Радионуклид 35S
Наработка радионуклида серы-35 проводится в ректоре облучением KCl или NaCl по реакции 35Cl + 0n —> 35S + 1p в виде 35S-сульфата. Некоторые специфические методики приготовления образцов KCl для облучения позволяют получать 35S в виде элементарной серы. Схема распада серы-35: 35S —> 35Cl + e . Удобный период полураспада и вполне приемлемая энергия β-излучения делают серу-35 очень популярным радионуклидом в своей "нише", вызывая досаду малой распространённостью соединений серы в живых организмах.
В life science сера-35 используется, в основном, для введения "метки" в белок за счет 35S-метионина или (реже) 35S-цистеина. Аминокислоты, меченные серой-35, получают биосинтезом, выращивая бактериальную биомассу на среде, содержащей 35S-сульфат. После кислотного гидролиза 35S-биомассы из белкового гидролизата выделяют аминокислоты. Иногда фирмы-производители вместо индивидуальных 35S-аминокислот предлагают просто 35S-белковый гидролизат, который может быть использован для выращивания культуры клеток в 35S питательной среде.
В 80-х годах ХХ-века на пике бума секвенирования ДНК с помощью радиоактивных изотопов фирма Амершам предложила использовать вместо нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 (или 33), нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные серой-35 по фосфатной группе, т.е. 35S- тиофосфаты. Однако, несмотря на широкую рекламу, большого распространения этот вариант секвенирования ДНК так и не получил. Во-первых, работа с радиоизотопами фосфора была привычней, а при массовой работе и регулярных поставках "свежей метки" надежней. Во-вторых, появившиеся вскоре флюоресцентные автоматические секвенаторы сделали это направление просто ненужным. Тем не менее, в арсенале life science остались нуклеозид-5' - [γ-35S] тиотрифосфаты и нуклеозид-5' - [α-35S] тиотрифосфаты для решения специальных задач, например, энзимологии протеинкиназ или энзимологии биосинтеза (деградации, коррекции) нуклеиновых кислот.
Главным недостатком соединений, меченных серой-35, которые используются в life science, является их низкая химическая стабильность. При том, что процессы радиолиза для этих соединений менее критичны, чем для трития или фосфора-32, 35S аминокислоты и тиотрифосфаты легко окисляются, поэтому их важно хранить при -20°С (лучше -70°С) и контролировать чистоту перед использованием.
10. Радионуклид 125I
Среди радиоактивных изотопов йода самым популярным для исследовательских работ в life science является 125I. Это реакторный изотоп, получающийся из стабильного изотопа ксенон-124. Среди радионуклидов в таблице, приведенной в разделе 4, йод-125 единственный γ-излучатель, хотя тип распада (точнее ядерного превращения) — электронный захват, в результате которого йод превращается в теллур с выделением γ-кванта. Йод-125 — очень удобный для детекции радионуклид. Во-первых, его можно измерять сцинтилляционным γ-счетчиком (не путайте с жидкостным сцинтилляционным β-счетчиком), и весь радиоиммуноанализ в пробирочном варианте был построен на этих измерениях. Во-вторых, йод-125 прекрасно детектируется авторадиографически на рентгеновской пленке или "электронной авторадиографией" с помощью имиджера. Наконец, йод-125 можно измерять на жидкостном сцинтилляционном β-счетчике во флаконе с сцинтиллятором, как тритиевый образец, за счет электронов Оже.
Несмотря на широкое применение йода-125 в life science, собственно 125I-меченные соединения почти не используются. Правильнее говорить об использовании йода-125 для "мечения" биологических макромолекул, т.е. получения меченых соединений второй группы — модифицированных соединений (см. раздел 3). Поэтому самым востребованным соединением йода-125 в life science является раствор йодистого калия — K125I — исходный материал для введения радионуклида в нужную молекулу.
Основным "потребителем" йода-125 являются исследования белков и пептидов. Традиционно йодирование белков проводят в нейтральной или слабокислой среде в присутствии окислителя, который окисляет йодид, обеспечивая его реакцию с аминокислотными остатками белка. Легче всего йод присоединяется по остаткам тирозина и гораздо хуже — по остаткам фенилаланина, триптофана или гистидина. Йодированный тирозиновый остаток практически не меняет физико-химические и иммунологические свойства белка, что очень важно для дальнейшего использования меченого препарата. В качестве окислителя использовались самые различные агенты: хлорамин Т, "йодоген", перекись водорода с лактопероксидазой и даже катод полярографа (при электрохимическом окислении). Каждый метод имеет свои особенности, но общий недостаток для всех — это окисление, которое для многих белков приводит к потере (или изменениям) ими своих свойств и функций. Даже кратковременное воздействие окислителя (реакция с хлорамином Т длится обычно 30÷40 сек.) для многих белков недопустимо. Поэтому был предложен реагент Болтона-Хантера — реагент, ацилирующий свободные аминогруппы белков. Такая модификация белка проходит без окисления, однако ацилирование аминогруппы меняет физико-химические характеристики исходного белка и может значительно изменить его иммунологические свойства. Особенно это касается небольших молекул, например, пептидов, где количество антигенных детерминант ограничено размерами самой молекулы.
Тем не менее, йодирование белков и пептидов йодом-125 широко используется для различных исследований, особенно иммунологических, рецепторных, гормональных и др. Такие 125I-меченные пептиды также используются для исследований, связанных с распределением пептидов по органам и тканям экспериментальных животных и их фармакокинетике.
Были предприняты попытки использовать 125I для исследований нуклеиновых кислот. Действительно, можно "пройодировать" ДНК, используя хлорид таллия и K125I, для введения "метки" по остаткам цитидина (образуется 5-йодцитидин). Можно вводить 125I в ДНК за счет ферментативного синтеза, используя ДНК-полимеразу и [5-125I] цитидин-5' трифосфат - 125I-аналог dCTP. Тем не менее, широкого распространения эти методики не получили, так как особых преимуществ у 125I перед 32Р нет. Кроме того, высокомеченная 125I ДНК гораздо быстрее деградирует под действием продуктов радиолиза и электронов Оже, чем ДНК, меченная фосфором-32 или фосфором-33.
11. Основы радиационной безопасности
Всем, кто работает с источниками ионизирующего излучения, в том числе с радиоактивными веществами, приходится получать допуск к работе: проходить медкомиссию и сдавать экзамен по знанию норм и правил радиационной безопасности. Возможно, самым ярким примером тесного переплетения фундаментальных академических исследований и утилитарно-прикладных разработок являются правила работы с источниками ионизирующего излучения. Вся информация для проведения работ с радиоактивными веществами изложена в двух основных документах: "Нормы радиационной безопасности" (НРБ) и "Основные санитарные правила" (ОСП). Эти скучные строгие документы существуют уже более 30-ти лет. Регулярно (примерно раз в 10 лет) информация в этих документах обновляется в соответствии с развитием радиобиологических и биофизических исследований, вносятся изменения, иногда весьма серьезные, но общая структура документов не меняется. НРБ устанавливает нормативы по всем параметрам, связанным с радиоактивностью: дозы и уровни облучения, содержание различных радионуклидов в воде, воздухе и т.д., уровни загрязнения радионуклидами и пр. Следует подчеркнуть, что это не военно-технический или медико-терапевтический документ, а общие нормы, установленные для всех организаций и лиц, постоянно работающих с источниками ионизирующего излучения, в том числе с радиоактивными веществами.