Енергія випромінювання характеризується електромагнітним спектром, що охоплює область від кілометрових радіохвиль до десятих часток ангстрема γ-випромінювання і космічних променів. Для характеристики ділянки спектра часто використовують також хвильове число θ, що показує, яке число довжин хвиль приходиться на 1 см шляху випромінювання у вакуумі, і визначається співвідношенням: θ = 1/λ.
Природа смуг поглинання в ультрафіолетовій (10–400 нм) і видимої (400–760 нм) областях спектра однакова і зв'язана головним чином з числом і розташуванням електронів у поглинаючих молекулах і іонах. В інфрачервоній області (0,8–1000 мкм) вона в більшому ступені зв'язана з коливаннями атомів у молекулах поглинаючої речовини.
У залежності від використовуваної апаратури у фотометричному аналізі розрізняють спектрофотометричний метод – аналіз по поглинанню монохроматичного світла і фотоколориметричний – аналіз по поглинанню поліхроматичного (немонохроматичного) світла у видимій області спектра. Обидва методи засновані на пропорційній залежності між світлопоглинанням і концентрацією поглинаючої речовини.
При проходженні через шар речовини (розчину) світлового потоку з інтенсивністю I0 його інтенсивність у результаті поглинання в шарі, відображення і розсіювання зменшується до значення I. Інтенсивності падаючого світлового потоку I0 і світлового потоку I, що пройшов через розчин, можна визначити експериментально. При відносних вимірах поглинання світла щирими розчинами утратами випромінювання унаслідок відображення і розсіювання звичайно зневажають.
Зв'язок між інтенсивностями світлових потоків I0 і I установлюється законом Бугера-Ламберта, відповідно до якого однорідні шари тієї самої речовини однакової товщини поглинають ту саму частку падаючої на них світлової енергії (при постійній концентрації розчиненої речовини).
Математично цей закон виражається рівнянням експонентної залежності:
I = I0eal (1),
де е – основа натуральних логарифмів; а – коефіцієнт поглинання; l – товщина поглинаючого шару.
Відношення:
T = I/I0
називають пропусканням; його значення можуть змінюватися від 0 до 1. Часто цю величину виражають у відсотках. Якщо величина Т віднесена до товщини шару в 1 см, то її називають коефіцієнтом пропускання. Поглинання випромінювання характеризують оптичною щільністю:
A = lg(I0/I) = –lgT
Зв'язок між концентрацією поглинаючого розчину і його оптичною щільністю lg(I0/I) виражається законом Бера, відповідно до якого оптична щільність розчину прямо пропорційна концентрації розчиненої речовини при постійній товщині шару:
lg(I0/I) = k*1*C (2)
де k*1 – коефіцієнт пропорційності; С – концентрація розчиненої речовини. Залежність інтенсивності монохроматичного світлового потоку, що пройшов через шар забарвленого розчину, від інтенсивності падаючого потоку світла, концентрації забарвленої речовини і товщини шару розчину визначається об'єднаним законом Бугера-Ламберта-Бера, що є основним законом світлопоглинання і лежить в основі більшості фотометричних методів аналізу:
I = I0*10–kCl (3)
де k – коефіцієнт светопоглощения, що залежить від природи розчиненої речовини, температури, розчинника і довжини хвилі світла.
При дотриманні основного закону светопоглощения оптична щільність розчину прямо пропорційна молярному коефіцієнту светопоглощения, концентрації поглинаючого речовини і товщині шаруючи розчину:
А = kCl (5)
При графічному зображенні залежності оптичної щільності від концентрації (при постійному значенні l) виходить пряма лінія. Ця пряма проходить через початок координат при відсутності поглинання світла розчинником і систематичними погрішностями.
Рівняння 4 і 5 виведені для монохроматичного світла, тобто світла визначеної довжини хвилі, що може бути виділений за допомогою спеціального оптичного пристрою – монохроматора. У фотоколориметрі вимір інтенсивності світлових потоків роблять не в монохроматичному, а в поліхроматичному світлі, тобто на досить широкій ділянці спектра – в інтервалі довжин хвиль 20–100 нм.
Спектр поглинання, чи, більш коректно, абсолютний спектр поглинання речовини являє собою залежність кількості поглиненого світла від довжини хвилі.
Такі спектри для барвників у видимій області (400–700 нм) мають іноді кілька максимумів. Спектри поглинання в ультрафіолетовій (200–400 нм) і видимих областях відбивають переходи зв'язаних і незв'язаних електронів у молекулі.
Це звичайно делокализованные π-електрони подвійних С=С зв'язків і неподілені пари азоту і кисню. Оскільки, як правило, всі електрони в молекулі при кімнатній температурі знаходяться на нижньому енергетичному рівні, спектри в цій області подають інформацію про основному і першому збудженому електронні стани молекули.
Через те, що довжина хвилі поглиненого світла відповідає визначеному переходу, піки на спектрах поглинання речовини обумовлені присутністю в ньому відомих структур. Довжина хвилі, при якій спостерігається максимальне поглинання світла, позначається через λмакс. Положення максимуму спектра поглинання є важливою оптичною характеристикою речовини, а характер і вид спектра поглинання характеризують його якісну індивідуальність.
Група в молекулі, що дає внесок у спектр її поглинання, називається хромофором. Такою групою є, наприклад, карбонільна група >С=О, що існує у всіх амінокислот. Іншим хромофором є пептидная група поліпептидних ланцюгів. До основних хромофорів білка відносяться залишки ароматичних кислот: триптофан і в меншому ступені тирозин і фенілаланін.
Спектр поглинання триптофану, обумовлений його індольним кільцем із системою сполучених зв'язків, володіє двома смугами поглинання з максимумами при 220 і 280 нм. У нуклеїнових кислотах основними хромофорами є пуринові і пиримідинові азотисті основи нуклеотидів. При утворенні сполучених зв'язків у молекулі енергія збудженого стану електронів зменшується, і, отже, хромофор починає поглинати світло більшої довжини хвилі.
Таке зрушення в спектрах поглинання називається батохромним. Навпаки, зрушення спектра в короткохвильову область іменується гіпсохромним. Гіперхромний і гіпохромний ефекти – це відповідно збільшення і зменшення екстинкції.
Знайти дуже близько розташовані лінії коливальних і обертальних переходів на спектрах молекул удається лише при високій роздільній здатності (роздільною здатність називається здатність приладу розрізняти дві близько розташовані лінії).
Фотометричні методи визначення концентрації розчинів засновані на порівнянні поглинання при пропущенні світла стандартними і досліджуваними розчинами. Ступінь поглинання світла фотометруємим розчином вимірюють за допомогою фотоколориметрів і спектрофотометрів. Вимір оптичної щільності стандартного і досліджуваного забарвлених розчинів завжди роблять стосовно розчину порівняння (нульового (контрольного) розчину). Як розчин порівняння можна використовувати аліквотну частину досліджуваного розчину, що містить усі додані компоненти, крім реагенту, що утворить з обумовленою речовиною забарвлену сполуку. Якщо реагент, що додається, і всі інші компоненти розчину порівняння безбарвні і, отже, не поглинають променів у видимій області спектра, то як розчин порівняння можна використовувати дистильовану воду.
Для визначення змісту речовини методом градуировочного (каліброваного) графіка готують серію з 5–8 стандартних розчинів різних концентрацій.
При виборі інтервалу концентрацій стандартних розчинів керуються наступними положеннями:
а) він повинний охоплювати область можливих змін концентрації досліджуваного розчину; бажано, щоб оптична щільність досліджуваного розчину відповідала приблизно середині градуювочної кривої;
б) бажано, щоб у цьому інтервалі концентрацій при обраних товщині кювети l і аналітичній довжині хвилі λ, (у більшості випадків λ = λмакс світлопоглинаючої сполуки) дотримувався основний закон світлопоглинання, тобто графік А = f(C) був лінійним;
в) інтервал робочих значень λ, що відповідає інтервалу стандартних розчинів, повинний забезпечувати максимальну відтворюваність результатів вимірів.
При сукупності перерахованих умов вимірюють оптичні щільності стандартних розчинів щодо розчинника і будують графік залежності А = f(C). Отримана крива називається градуювочною чи каліброваною і має вид прямої що виходить з початку координат. Екстраполювати калібровану пряму до значень оптичних густин, що лежать вище останньої експериментально отриманої крапки, не рекомендується. Періодично (раз у тиждень чи рідше) калібровану криву перевіряють по 2–3 свіжовиготовленим стандартним розчинам. Калібровані графіки, побудовані з реактивами різних партій, як правило, не збігаються. Тому при зміні реактивів графік необхідно побудувати заново. Графік, побудований при роботі на одному приладі, не можна використовувати для розрахунків результатів, отриманих на іншому.
Визначивши оптичну щільність досвідченого розчину Ах, знаходять її значення на осі ординат, а потім на осі абсцис – відповідне їй значення концентрації Сх.
Цей метод застосовують при виконанні серійних фотометричних аналізів. Він дає гарні результати при дотриманні основного закону світлопоглинання.
На відміну від інших фотометричних методів, метод градуювочного графіка дозволяє визначити концентрацію пофарбованих розчинів навіть у тих випадках, коли основний закон світлопоглинання не дотримується. Для побудови градуювочної кривої в цих випадках наготовлюють значно більше число стандартних розчинів, що відрізняються друг від друга по концентрації не більше ніж на 10%. Такий градуировочный графік, що має на положистій ділянці кут нахилу не менш 15°, усе-таки дозволяє проводити фотометричні виміри, незважаючи на те, що між концентрацією розчину і його оптичною щільністю немає лінійної залежності. Відтворюваність визначень у цьому випадку нижче, ніж у випадку лінійної залежності А = f(C).