Витамины В12 и В15

Содержание

Введение Краткийисторическийочерк Номенклатуракорриноидов Химия витаминаВ12 Строение Кобаламины Кислотныйгидролиз витаминаB12 Нуклеотид Продуктымягкого кислотногогидролиза ФакторВ Щелочнойгидролиз Продуктыокисления Восстановлениевитамина B12 Реакцияс галогенами Метилирование Рентгеноструктурныйанализ Устойчивость Механизмдействия Отношениек сульфгидрильнымферментам Обменжиров и каротина Участиевитамина В12в биохимическихвосстановительныхпроцессах Биосинтезметионина исерина Синтезнуклеиновыхкислот Белковыйобмен Другиевозможныефункции НекоторыеВ12-зависимыеферменты Диолдегидратаза Глицеролдегидратаза Этаноламин-аммиак-лиаза Аденозилкобаламин-зависимыемутазы Глутаматмутаза Метилмалонил-СоА-мутаза 2-метиленглутаратмутаза Ферменты,трансформирующиеα, ω-диаминокислоты Рибонуклеотидредуктаза Витамин В15 Получениеи аналогивитамина В15 Механизмдействия Клиника ВитаминВ12 ВитаминВ15 Заключение Списокиспользованнойлитературы

3 4 4 6 7 7 8 8 9 9 10 11 11 12 12 13 14 15 16 16 16 17 20 21 23 23 24 24 25 25 25 26 27 27 28 29 29 29 31 31 32 33 34

Введение

Lascante ogni speranza voi ch’entrate!

Dante

Витамины(от лат. Vita– жизнь) - группаорганическихсоединенийразнообразнойхимическойприроды, необходимыхдля питаниячеловека, животныхи других организмовв ничтожныхколичествахпо сравнениюс основнымипитательнымивеществами(белками, жирами,углеводамии солями), ноимеющих огромноезначение длянормальногообмена веществи жизнедеятельности.

Первоисточникомвитаминовслужат главнымобразом растения.Человек и животныеполучают витаминынепосредственнос растительнойпищей или косвенно– через продуктыживотногопроисхождения.Важная рольв образованиивитаминовпринадлежиттакже микроорганизмам.Например, микрофлора,обитающая впищеварительномтракте жвачныхживотных,обеспечиваетих витаминамигруппы В. Витаминыобразуют ворганизмебольшое количестворазнообразныхпроизводных(например, эфирные,амидные, нуклеотидныеи др.), которые,как правило,соединяютсясо специфическимибелками, выступаяв роли коферментов.Наряду с ассимиляцией,в организмепостоянноосуществляетсядиссимиляциявитаминов,причем продуктыих распада, аиногда и малоизмененныемолекулы витаминоввыводятсянаружу. Недостаточностьснабженияорганизмавитаминамиведет к егоослаблению,резкий недостатоквитаминов –к нарушениюобмена веществи заболеваниям– авитаминозам,которые могутзакончитсягибелью организма.Авитаминозымогут возникатьне только отнедостаточногопоступлениявитаминов спищей, но ивследствиенарушенияпроцессов ихусвоения ииспользованияорганизмом.

Основоположникучения о витаминахрусский врачН. И. Лунин установил(1880), что при кормлениибелых мышейтолько искусственныммолоком, состоящимиз казеина,жира, лактозыи солей, животныепогибают.Следовательно,в натуральноммолоке содержатсядругие вещества,незаменимыедля питания.В 1912 году польскийврач К. Функпредложил самоназвание «Витамины»,обобщил накопленныек тому времениэкспериментальныеи клиническиеданные и пришелк выводу, чтотакие заболевания,как рахит, цинга,пеллагра, бери-бери,- болезни витаминнойнедостаточности.С этого временинаука о витаминах(витаминология)начала интенсивноразвиваться,что объясняетсязначениемвитаминов нетолько дляборьбы со многимизаболеваниями,но и для познаниясущности рядажизненныхявлений. Методобнаружениявитаминов,примененныйЛуниным (содержаниеживотных наспециальнойдиете – вызываниеэкспериментальныхавитаминозов),был положенв основу исследований.

Обавитамина, которымпосвящен этотреферат, впервыебыли обнаруженыв экстрактахпечени высшихживотных. Действиеобоих из нихсвязано с переносомметильнойгруппы от одноймолекулы кдругой, причемпангамоваякислота можетявляться доноромметильнойгруппы, а витаминВ₁₂ – промежуточнымпереносчиком.Однако еслиотносительнопринадлежностицианкобаламинак витаминамспоров не возникает,то причислениек ним пангамовойкислоты оспариваетсябольшинствомученых. В«ЭнциклопедическомХимическомСловаре», например,утверждается,что факт принадлежностипангамовойкислоты к витаминамне доказан,Березовскийв своей книге«Химия Витаминов»приводит статьюо пангамовойкислоте в заключающейкнигу рубрике«Некоторыебиологическиактивные вещества».Вообще сведенияо витамине В₁₅,доступные мне,оказалисьвесьма скудныи в основномзатрагиваютвопросы егоклиническогопримененияв ущерб химическимсвойствам.

Краткийисторическийочерк

ВитаминВ12, пожалуй, самыйсложный из всехвитаминов,впервые заявило себе научномумиру, когда в1926-м году американскиеврачи ДжорджМино и УильямМэрфи обнаружили,что включениев состав питаниябольших количествполусыройпечени оказываетлечебное воздействиепри злокачественнойанемии. Однакопопытки выделенияантианемическогофактора к успехуне привели.Лишь в конце40-ых годов МэриШорб обнаружилавид бактерий,рост которыхзависел отэтого фактора,благодаря чемуу ученых появиласьвозможностьоцениватьсодержаниевитамина вданном субстратепо скоростироста колонии.В 1948 г. Э. ЛестерСмит (Англия),а также ЭдвардРикес и КарлФолкерс (США)получили витаминВ12 в кристаллическомвиде.

Однакопотребовалосьеще десять летдля того, чтобыметодомрентгеноструктурногоанализа определитьего структуру,которая оказаласьчрезвычайносложной. Зарасшифровкуструктурывитамина В₁₂(1955 г.) Дороти Ходжкинбыла присужденанобелевскаяпремия.

ВитаминВ₁₅ (пангамоваякислота) былвпервые обнаруженв 1950-м году Томиямойв экстрактепечени быка.Название пангамовойкислоты происходитот латинскихкорней «пан»- всюду и «гами»- семя, так какпозже она былаобнаруженав составе семяногромногоколичестварастений.

Номенклатуракорриноидов

Ц

Рисунок 1.Структуракорриноидов.

R₁=OH– кобириноваякислота; R-NH₂;R₁=OH– кобироваякислота; R-OH; R₁-остаток1-амино-2-пропанола– кобиноваякислота; R=NH₂;R₁-остаток1-амино-2-пропанола– кобинамид;R=OH; R₁-остатокD-рибофуранозил-З-фосфата– кобамоваякислота; R-NH₂:R₁=остатокD-рибофуранозил-З-фосфата– кобамид

ианкобаламинотносится кклассу корриноидов- производныхкоррина, структуракоторого родственнапорфирину.Однако, нарядус близостьюих структур,имеются дваважных химическихразличия междуэтими макроциклами.В то время какпорфирин содержитсистему из 12сопряженныхдвойных связей,коррин состоитиз частичновосстановленныхпиррольных(пирролиновых)гетероциклов.Корриновоекольцо содержит6 двойных связей,входящих всостав линейнойсопряженнойсистемы, включающей12 из 15 атомов,составляющихвнутреннийконтур макроцикла.Корриновоекольцо суженопо сравнениюс порфириновым.Если в порфиринекаждая парапиррольныхколец отделенаметиновымимостиками, тов коррине кольцаА и D соединенынепосредственносвязью междуα-положениями.Поэтому внутреннийконтур корриновогомакроцикласодержит наодин атом углеродаменьше, чемпорфириновый.

В

Рисунок 2.Нумерацияатомов в молекулецианкобаламина.

соответствиис номенклатуройкорриноидов,утвержденнойв 1975 г. Международнойкомиссией побиохимическойноменклатуре,органическийэкваториальныйлиганд, состоящийиз четырехвосстановленныхпиррольныхколец с атомомкобальта вцентре, названкоррином, асоединенияего содержащие- корриноидами.Гептакарбоноваякислота, изображеннаяна рис. 1, названакобириновойкислотой.Карбоксильныегруппы обозначеныбуквами а-g, какпоказано наэтом рисунке.a,b,c,d,e,g-гексаамидкобириновойкислоты названкобировойкислотой. Кобиноваякислота являетсяамидом кобириновойкислоты сD-1-амминопропанолом-2в положенииf; его гексаамидназван кобинамидом.Кобамоваякислота являетсяфосфодиэфирнымпроизводнымкобиновойкислоты, в которомгидроксил 2положенияаминопропанолазамещен остаткомα-D-рибофуранозил-З-фосфата;его гексаамидназван кобамидом.Кобамиды, которыеимеют 5,6-диметилбензимидазольныйлиганд, связанныйгликозиднойсвязью черезN1 с С1 рибофуранозы,называютсякобаламинами.Корриноиды,имеющие вα-аксиальномположениивместо 5,6-дииметилбензимидазоладругие основания,также называютсякобамидами.

Химиявитамина В₁₂

В

Рисунок 3.Структурацианкобаламина.

итамин B₁₂кристаллизуетсяв виде темно-красныхигл или призм;цвет варьируетв зависимостиот величиныкристаллов.Кристаллытемнеют при210-220°, но не плавятсяпри температурениже 300⁰Ц. Первымиустановленнымиконстантамибыли показателипреломления,а именно α = 1,616, β= 1,652, γ = 1,664. Кристаллографическиеизмеренияпоказывают,что кристаллыотносятся корторомбическойсистеме и имеютпризматическуюформу. Прикристаллизациииз водногораствора и изсмеси воды сацетоном онисодержатзначительное,но изменчивоеколичествонепрочно связаннойкристаллизационнойводы. Ее можноудалить нагреваниемпри пониженномдавлении, причемкристаллы нетеряют своейформы. Послеэтого обезвоженныйматериал можетснова поглощатьвлагу из атмосферноговоздуха в количестве10-12%; это и естьтот продукт,который обычновыпускаетсяпод названиемвитамина B12 изарегистрированв фармакопеяхАнглии и США.Витамин B12 довольнохорошо растворимв воде (около1,2% при комнатнойтемпературе),а также в низшихспиртах, в низшихалифатическихкислотах и вфенолах, нонерастворимво многих другихорганическихжидкостях. Онпрактическине растворяетсяв пиридине идругих третичныхаминах, но растворимв некоторыхжидких илирасплавленныхамидах, напримерв ацетамидеи диметилформамиде.Витамин являетсялевовращающимвеществом, ноинтенсивная,окраска затрудняетизмерениеоптическоговращения. ВитаминB12 обладаетдиамагнитнымисвойствами,что указываетна трехвалентноесостояниекобальта.

Обычновитамин выделяютиз микробноймассы или животныхтканей, используярастворы, содержащиецианид-ионы,играющие рольшестого лигандакобальта. Однакосам цианкобаламинметаболическине активен. Всостав ферментоввходит соединение,в котором цианогруппазамещена остатком5-дезоксиаденозинаили метильнымрадикалом.

Строение

Признаннаяформула витаминаB₁₂ –C₆₃H₈₈O₁₄N₁₄PCo.Молекулу можноподразделитьна две основныечасти, известныекак "планарнаягруппа" и "нуклеотид";вторая частьлежит в плоскости,почти перпендикулярнойк плоскостипервой части,которая обладаеточень большим,хотя и неполным,сходством спорфиринамиЦентральныйатом кобальтасоединен счетырьмявосстановленнымипиррольнымикольцами, образующимимакрокольцо.Три из четырехсоединениймежду кольцамиобразованымезоуглеродныматомом (углеродныммостиком),характернымдля порфиринов.Однако в четвертомместе соединениясуществуетпрямая связьмежду двумяα-углероднымиатомами колецD и А. Макрокольцосодержит 6сопряженныхдвойных связей,образующихединую сопряженнуюсистему.

У13 из 19 углеродныхатомов, составляющихмакрокольцо,водород полностьюзамещен метильнымигруппами илидлинными боковымицепями – либоацетамидными,либо пропионамиднымирадикалами

Вотличие отнуклеотидовнуклеиновыхкислот такназываемыйнуклеотидвитамина B₁₂не содержитпурина илипиримидина.Вместо нихоснованиемслужит 5,6-диметилбензиминазол.Сахар представленрибозой, но сα-гликозндпойсвязью, опять-такив отличие отβ-связи в нуклеиновыхкислотах. Рибозафосфорилированапри 3-м атомеуглерода. Фосфатобразует эфирнуюгруппу с1-амино-2-пропиловымспиртом, который,кроме того,соединен амиднойсвязью с цепьюпропионовойкислоты прикольце D. Наконец,атом кобальтанесет CN-группу(в цианкобаламине)и соединенкоординационнойсвязью с однимиз атомов азотав бензиминазоле,образуя, такимобразом, второймостик междудвумя частямимолекулы. Полагали,что третийгидроксилфосфатнойгруппы тожеэтерифицирован,пока не сталоясно, что неустойчивостьтриэфировфосфорнойкислоты исключаеттакую структуру.Витамин B₁₂является посуществу внутреннейсолью; отрицательныйзаряд на атомефосфора нейтрализованположительнымзарядом накоординационномкомплексекобальта.

Кобаламины

Первыехимическиеданные о витаминеB₁₂ содержалисьв одновременныхсообщенияхиз лабораторииГлаксо и Мерка,в которых указывалосьна присутствиев его молекулекобальта ифосфора. Самыеранние английскиепубликациикасались второгокрасного фактора,появляющегосяна хроматограммахнаряду с витаминомB12; Этот факторбыл полученв кристаллическомвиде Пирсоми его Сотрудникамив лабораторииЛедерле и былназван витаминомB_12b. Тем временемисследователииз лабораторийМерка описаливитамин В_12акак вещество,образующеесяпри обработкевитамина В₁₂водородом вприсутствииплатиновогокатализатора.Позже он оказалсяидентичнымвитамину В_12b.В лабораторияхГлаксо былоописано ещеодно родственноесоединение– витамин B_12c.В 1950 г. отношениямежду этими"витаминамиB₁₂" выяснилисьв результатепочти одновременныхсообщений излабораторий"Органон"(Голландия) иМерка, в которыхбыло показано,что витаминB₁₂ содержитгруппу цианида,соединеннуюкоординационнойсвязью с кобальтом.Группу цианидаможно былоудалить фотолизомили путемвосстановленияв определенныхусловиях свыходом витаминаB_12a, который,как предполагали,содержит наместе цианидагидроксильнуюгруппу. Приобработкеводным растворомцианида витаминB_12a быстропревращаетсяв тот пурпурныйдицианидныйкомплекс, которыйвозникает изсамого витаминаB₁₂. После подкислениявторая группацианида теряетсяи остаетсявитамин B₁₂. Длявсей молекулыB₁₂, исключаягруппу цианида,был предложентермин "Кобаламин",так что витаминB₁₂ стал называтьсяцианкобаламином,а витамин B_12aоксикобаламином.Эта терминологияполучила широкоепризнание.

Путемобработкивитамина B_12aразличнымикислотамиудалось получитьряд другиханалогов. К нимотноситсявитамин B_12c,содержащийгруппу азотистойкислоты; он былназван нитриткобаламином,или нитрокобаламином.По-видимому,витамин B_12aобычно существуетне в формеоксикобаламина,а в форме аквокобаламина,молекула которогосодержит нейтральнуюмолекулу воды,что сообщаетвсему координационномукомплексуосновные свойства;это согласуетсяс данными отом, что соединениетитруется какоснование.Можно получитьдругие основныекобаламины,содержащиевместо водымолекулу аммиакаили некоторыхаминов. Кромеэтих основныхи нейтральныхсоединений,существуетеще класс кислыхкобаламинов.Из них наиболееизвестно пурпурноевещество,образующеесяпри добавленииизбытка цианида,к витамину B₁₂.Оно содержит2 молекулы цианида,соединенныекоординационнымисвязями с кобальтом.Бивен и сотр.получили довольноубедительныеспектроскопическиеданные о наличиикоординационнойсвязи междусвободныматомом азотав бензиминазолеи кобальтом.Избыток цианидаразрывает ее,по-видимому,потому, что ионцианида образуетс металломболее прочнуюкоординационнуюсвязь. Дицианосоединение,однако, устойчивотолько в щелочномрастворе.Дицианкобаламинлегко замещаетцианогруппуна ОН^-, NO₂^-,SO₃^-, Cl^-,Br^-, SCN^-и пр. Все производныев присутствиицианид-ионовпревращаютсяв цианкобаламин.

Устойчивостьи взаимопревращенияразличныхклассов Кобаламиновизучали с помощьюизотопов идругими методами.Все эти веществабез исключенияпревращаютсяв витамин B₁₂под действиемцианида. Неудивительнопоэтому, чтовсе они обнаруживаютбиологическуюактивностьв отношениимикроорганизмов,а также животныхи больныхпернициознойанемией, хотянекоторые изних менее активны,чем цианкобаламин.

Досих пор мырассматриваливитамин В₁₂как нейтральноевещество, хотяв действительностиэто чрезвычайнослабое основание.Это обнаружилосьеще в раннихисследованияхпри титрованиив растворахуксусной кислоты.

Кислотныйгидролиз витаминаB₁₂

Приобработкевитамина B₁₂неорганическимикислотами вразличныхусловиях полученомного продуктоврасщепления.Одним из первыхбыл идентифицированаммиак, образующийсяпри гидролизеамидных групп.Химическоеизучение концентратовантипернициозногофактора привелок предположению,что он представляетсобой веществополипептиднойприроды. Однакопри исследованиикислотныхгидролизатовобычным методомхроматографиина бумаге вчистых образцахкристаллическоговитамина ненашли никакихпризнаковналичия α-аминокислот.Тем не менее,группа исследователейиз Британскойпалаты медицинскихпрепаратовобнаружилана хроматограммепятно, дающеенингидриновуюреакцию^*;эта реакциябыла обусловленане аминокислотой,а пропаноламином.

Привзаимодействиис концентрированнойHCl при 65^оСпроисходитотщеплениенуклеотидаи образованиекобинамида(фактора В –см. ниже), затемпроисходитотщеплениеи образованиекобировойкислоты (фактораV_1a).

Нуклеотид

Прикислотномгидролизевитамина B₁₂в жестких условияхобразуется5,6-диметилбензиминазол.Было показано,что полностьюнуклеотидсоответствуетназванию1-α-D-рибофуранозид-5,6-диметилбензиминазол.Сомнительнымоставалосьтолько то, вкаком положении- 2 или 3 - фосфорилированарибоза. Окончательноэтот вопросбыл решен лишьс помощьюрентгеноструктурногоанализа.

Продуктымягкого кислотногогидролиза

Впервом приближении,мягкий гидролизразбавленнойхлороводороднойкислотой приводитк частичномудезаминированию,последовательномуобразованиюмоно-, ди-, три-,тетра-, пента-,гекса-, гептакарбоновыхкислот с сохранениемнуклеотида.

Продолжительнаяобработкавитамина B₁₂холодной разведеннойсоляной кислотойприводила кмедленнойпотере микробиологическойактивности,при этом интенсивностькрасной окраскине изменялась.Было обнаружено,что с увеличениемдлительностигидролизавозникает всеболее сложнаясмесь продуктов.Среди них одно-,двух-, трех- ичетырехосновныекислоты, образующиесяпри последовательномудалении аммиакаиз амидныхгрупп. При добавленииазотистойкислоты в этихусловияхобразовывалисьтакже небольшиеколичествапяти- и шестиосновныхкислот, обладающихкрасной окраской.Монокарбоновыекислоты можноразделить натри. Дикарбоновыекислоты такжеразделяютсяна три изомера;трикарбоновыекислоты фракционироватьне удавалось.Этого и следовалоожидать прислучайномгидролизе трехлабильныхамидных групп.Относительныеколичестваполучаемыхизомеров показывали,что одна изэтих группзначительнолабильнееостальных. Триостальныеамидные связигидролизовалисьтолько приобработкекислотой вболее жесткихусловиях илипри каталитическомвоздействииазотистойкислоты. Когдав результатерентгеноструктурногоанализа строениевитамина быловыяснено, появиласьвозможностьистолковатьэти наблюдения.Три лабильныеамидные группы,очевидно, принадлежаттрем цепямпропионамида,а три стабильныегруппы - ацетамиднымцепям.

Этоописание продуктовкислотногогидролизаупрощено, таккак, за исключениемслучаев самогомягкого гидролиза,при электрофорезевыявляласьеще одна группакислот. Этикислоты образуютсяв результатеотщепленияне только рядамолекул аммиака,но также инуклеотида.

В водномрастворе примягком кислотномгидролизе (атакже фотолитическиили при каталитическомгидрировании)цианкобаламин,через промежуточнуюстадию В_12r(см. Восстановлениевитамина В₁₂)с последующимокислениемкислородомвоздуха переходитв оксикобаламин.

ФакторВ

Исследователииз лабораторииГлаксо нашли,что молекулувитамина можноаккуратноразделить надве частикратковременнымнагреваниемс концентрированнойсоляной кислотойили, еще лучше,с хлорной кислотой.При тщательноконтролируемыхусловиях (например,5 мин при 65°) амидныегруппы почтине подвергалисьгидролизу иглавными продуктамибыли, нуклеотиди неизмененнаяостальная частьмолекулы. Последнийпродукт сохранялмикробиологическуюактивностьи оказалсяидентичнымприродномуфактору, выделенномуиз содержимогорубца жвачных.В присутствиицианида растворыэтого веществаимели пурпурнуюокраску дажепри слабо кислойреакции среды.Спектр поглощениябыл очень сходенсо спектромдицианкобаламина,так что в этомсостояниивещество почтинаверное содержалодва остаткацианида, соединенныхкоординационнойсвязью с кобальтом.Однако в товремя какдицианкобаламинимел кислотныесвойства, новоесоединениебыло нейтральным.Причина такогоразличия состоялав отщеплениикислого нуклеотидногоостатка. Этонаблюдениепо существуявилось главнымоснованиемдля представленияо витамине B₁₂как внутреннейсоли.

Рядкислот, образующихсяпри гидролизеамидных группв факторе В,обладал тойже относительнойстабильностьюв их дициано-конфигурации.

Былиполучены указанияна то, что существует7-я карбоксильнаягруппа, связаннаяне с аммиаком,а через аминс нуклеотидом.Это подтверждалоболее раннеепредположениео том, что аминопропиловыйспирт служитмостиком междудвумя частямимолекулы, будучисоединеннымамидной связьюс одной из цепейпропионовойкислоты в планарнойгруппе и эфирнойсвязью - с фосфорнойкислотой. Вкислых растворах(с рН примерноменее 3) факторВ теряет обегруппы цианидаи ведет себякак основание.Соответствующиекислоты ведутсебя сходнымобразом, таккак карбоксильныегруппы неподвергаютсязаметной ионизации.Поэтому всевещества, несодержащиенуклеотида,можно отделитьот веществ, ещесохранившихего.

Щелочнойгидролиз

Жесткийщелочной гидролизприводит котщеплению5,6-диметилбензимидазолаи образованиюдилактампента-и монолактамгексакарбоновыхкислот.

П

Рисунок 4.Рисунок 4. ДегидровитаминВ₁₂ (Строениекольца В корриновогомакроциклаи прилегающихк нему структур)

Рисунок 5.Гексакарбоноваякислота, образующаясяпри щелочномгидролизе.

ри обработкевитамина B₁₂перекисьюводорода иразведеннойщелочью нахолоду и получаютсямикробиологическиактивные кислыепродукты красногоцвета. Реакциясостоит в гидролизе,катализируемомперекисьюводорода. Однакополученныекристаллическиепродукты,по-видимому,представлялисобой смесимоно- и дикарбоновыхкислот, образовавшихсяв результатемягкого гидролиза,с неизмененнымвитамином B₁₂,который обусловливалих биологическуюактивность.Под действиемхолодной разведеннойщелочи, по-видимому,образуютсяте же продукты,что и при мягкомкислотномгидролизе.Однако в присутствиигорячей щелочиреакция идетпо-иному. Еслинагреватьвитамин B₁₂ врастворе NaOHв отсутствиекислорода, тоокраска становитсякоричневой,а затем приобретаетзеленоватыйоттенок, этоможет указыватьна уменьшениевалентностиатома кобальта,сопровождающеесяокислениемкакой-то другойчасти молекулы.При доступевоздуха цветснова становитсякрасным. Кратковременноекипячение сощелочью придоступе воздухадает в качествеглавного продуктанейтральноекристаллизующеесякрасное вещество.Оно почти неотличимоот витаминаB₁₂ по физическимсвойствам, ноне обладаетмикробиологическойактивностью.Структура этогосоединениябыла выясненаглавным образомпутем рентгеноструктурногоанализа кристаллов.Продукт, по-видимому,содержит лактамноекольцо, имеющее2 общих атомас кольцом В иобразующеесяиз ацетамиднойцепи; остальнаячасть молекулытакая же, чтои в самом витамине.Добавлениетиогликолатанатрия илицианида натрияк растворувитамина восновном защищаетего от воздействиящелочи и кислорода.Полагают, чтореакция протекаетпри участиисвободныхрадикалов.Производное,содержащеелактам, былоназвано дегидровитаминомB₁₂. Лактамноекольцо чрезвычайноустойчиво ипри дальнейшемвоздействиищелочи сохраняется.При гидролизепоследовательноотщепляютсяостающиесяамидные группыи нуклеотид.Таким образом,получаютсядва ряда кислот– с нуклеотидоми без нуклеотида,- но все ониотличаютсяот соответствующихпродуктовкислотногогидролиза.Конечным продуктомщелочногогидролизаявляетсягексакарбоноваякислота, а негептакарбоновая,как при кислотномгидролизе. Этосвязано с участиемодной из потенциальныхкислотных группв построениилактамногокольца. Основноезначение этогокристаллическогопродукта распадасостоит виспользованииего для рентгеноструктурногоанализа.

Продуктыокисления

Исследованиегидролиза далоценные сведенияо том, что можнобыло бы назватьперифериеймолекулы. Гораздотруднее оказалосьизучить химическимиметодами структуручасти молекулы,непосредственноокружающейатом кобальта.Кембриджскаягруппа показала,что среди продуктовокислениявитамина B₁₂нельзя обнаружитьамида м

Рисунок 6.Продукты окисления.

алеиновойкислоты, такчто вряд лиможно былоотносить витаминк истиннымпорфиринам.Но эти исследователивыделили вдовольно большомколичествеоксамовуюкислоту. Единственныеазотсодержащиепродукты расщепления"ядра" молекулывыделили в 1955г. Фолкерс исотр. Контролируемоеокислениехроматом натрияв уксуснойкислоте привелок образованиюдвух продуктов,изображенныхна рисунке 6 (1и 2). Полагали,что они образуютсяиз группировки,имеющей пирролидиновую,пирролиновуюили пирролениновуюструктуру (рис.6, 3). Это были первыехимическиеданные, указывающиена присутствиепирролоподобнойструктуры вмолекуле, еслине считатьболее раннихданных по пиролизу,позволявшихпредполагатьтакую структуру.Несколько позжебыл выделени соответствующийпродукт, содержащийамидную группу(амид кислоты,представленнойна рис. 6, 2). Этоявилось прямымхимическимподтверждениемместоположенияпо крайнеймере, одной изамидных групп.

ПриокислениицианкобаламинаН₂О₂ в средес рН меньшесеми наблюдаетсявыход продуктов,обладающихантагонистическимбиологическимдействием дляlactobacillus leichmannii,в отличие отростового дляEuglena gracilis.При окисленииперманганатомкалия отщепляетсясинильнаякислота, а такжеобразуютсяуксусная кислота,щавелеваякислота и ееамид, бутандиоваякислота, 2-метилбутандиоваяи 2,2-диметилпропандиоваякислоты.

Восстановлениевитамина B₁₂

Прикаталитическомгидрированиина платиновомкатализаторецианкобаламинприсоединяетпять атомовводорода иотщепляетметиламин,кобальт переходитв двухвалентноесостояние собразованиемт. н. В_12r.При длительномвосстановлениии при использованииболее сильныхвосстановителей,таких как ацетатхрома при рН9,5 или борогидриднатрия получаюттак называемыйВ_12s,содержащийодновалентныйкобальт.

Восстановлениевнесло разочаровывающемалый вкладв наши знанияо строениивитамина, идаже теперьдетальнаяструктурапродуктоввосстановленияеще достаточноне выяснена.Обработкаводородом вкачестве катализатораили некоторымидругими восстановительнымиагентами вызываетпереход окраскив коричневуюи, наконец, всеро-зеленую.Эти изменения,за исключениемпотери цианида,обратимы приконтакте скислородомвоздуха, причемобразуетсявитамин B_12а.Вопрос об измененияхвалентностикобальта,происходящихпри восстановлении.Работа Бивенаи Джонсона,появившаясяпосле опубликованияпредположительнойструктурывитамина, пролиланекоторый светна не решенныйеще вопрос отом, содержитон 5 или 6 сопряженныхдвойных связей.

Обратимоевосстановлениелегко продемонстрировать,добавляя кщелочномураствору витаминаB₁₂ тиогликолевуюкислоту. Краснаяокраска медленнопереходит воранжево-бурую;после встряхиванияраствора вприсутствиивоздуха онатотчас же вновьстановитсякрасной. Помере использованиякислорода сновамедленно появляетсяцвет восстановленноговитамина B₁₂.Эти измененияокраски можноповторно вызыватьпочти до бесконечности:окончательныйрезультатсостоит в том,что витаминкатализируетокислениетиогликолевойкислоты (по-видимому,до дисульфида)кислородомвоздуха.

Реакцияс галогенами

Хлоробесцвечиваетраствор цианкобаламина,другие галогены– нет. Продуктомхлорированияявляется фиолетовоекристаллическоевещество.

Энергичноехлорированиевитамина B₁₂давало продукт,содержащий30% хлора, природаего не былаохарактеризованаточнее. Петрови сотр. описалиряд продуктов,образующихсяпри обработкевитамина хлоромили хлораминомТ, которые можнобыло разделитьметодом хроматографии.Эти веществаимели пурпурныйцвет, переходящийпри избыткецианида в голубой,и содержали2 атома хлорав молекуле.

Воздействиеодной молекулыхлорамина Тили брома даетв качествеглавного продуктанейтральноекристаллизующеесявещество красногоцвета. По физическимсвойствам онобыло оченьсходно с витаминомB₁₂, но не обладаломикробиологическойактивностью.Электрофорези инфракраснаяспектроскопиядоказали, чтоэто был лактон;полагают, чтоего строениеидентичностроению лактамапоказанногона рис. 5, тольковместо NH следуетпоставить О.Образованиелактона, по-видимому,связано спромежуточнымобразованиемиона карбонияв активированномβ-положениикольца В.

Йоддействует навитамин B₁₂только в щелочныхрастворах, ипри этом образуютсякак лактам, таки лактон, относительныеколичествакоторых зависятот концентрациищелочи и йода.

ДальнейшаяобработкахлораминомТ или бромомвела к образованиюпурпурныхвеществ, которыестановилисьголубыми приизбытке цианидаи содержалив молекулесоответственнохлор или бром.Эти продуктыне были полностьюохарактеризованы,но сходноевещество, возникавшеепри действиихлорамина Тна лактам(дегидровитаминB₁₂), было изученов Кембридже,и оказалось,что оно содержиттолько одинатом хлора.Полагают, чтохлор замещалводород примезоуглеродноматоме междукольцами В иС. Эта работав сочетаниис другими даннымипомогла установить,что в молекулевитамина имеется6 сопряженныхдвойных связей,а не 5, как предполагалосьвначале.

Метилирование

Придействии избыткаСН₃-HgJ наJCbl вспиртовомрастворе притемпературе65^оС в течениетрех часовможно получитьметилкобаламинс выходом около50%. Вообще реакциямикорриноидовс сильныминуклеофиламиполучаютсоответствующиеорганокорриноиды.

М

еждудиметилсульфатоми самим витаминомB₁₂ никакойреакции непроисходит,так как атомазота участвуетв координационнойсвязи с кобальтом.Эта связь должнабыть сначаларазорвана путемпревращениявитамина B₁₂в дицианкобаламин;даже и послеэтого реакциязависит отзначения рН.Образующийсяпри этом четвертичныйазот обусловливаетвозникновениедобавочнойосновной группыв молекуледицианида,которая в результатеэтого, обладаетнейтральнойреакцией (а некислой, какмолекуладицианкобаламина);эта структураустойчива вкислых растворах,так как метилированиепрепятствуетобразованиюкоординационнойсвязи междуN3 и Со. Эта реакциябыла использованадля изученияболее сложныхсвойств аналогавитамина B₁₂– фактора III,который можетбыть метилированили в любом издвух положенийили в обоиходновременно.

Рентгеноструктурныйанализ

И

Рисунок 7.Пространственнаяконфигурациямолекулы витаминаВ₁₂.

зучениевитамина B12 методомрентгеноструктурногоанализа началаДороти Ходжкинв Оксфорде в1948 г., как толькобыли полученыпервые кристаллы.Независимоподобную жеработу проводилУайт в Принстоне;позже обе группыисследователейобъединилисвои силы. Трудоемкиевычисленияна основе результатовизмеренияотражениирентгеновскихлучей позволилисоставить картыэлектроннойплотности втрех измерениях.Постепенно,в несколькопоследовательныхэтапов, по меретого как определялосьположение всебольшего числаатомов в структуре,расчеты уточнялись.Вся программаработы с витаминомB₁₂ и теми егоаналогами,которые былиполучены, потребовалапримерно около10 млн. вычислений.Для этого напоследнихэтапах пришлосьиспользоватьэлектронныесчетные машины.Никогда ещерентгеноструктурныйанализ не применялсядля изученияструктуры стольсложной молекулы,и полный успехэтой программыизучения явилсязамечательнымдостижением,несколькосмутившимхимиков-органикови, кажется, удивившимдаже самихспециалистовпо рентгеноструктурномуанализу. Какзаметила ДоротиХоджкин, "возможностьзаписать химическуюструктуруглавным образомна основаниичисто кристаллографическихданных о размещенииатомов в пространстве– и притом длятакой устрашающесложной молекулы- это для всякогокристаллографанечто похожеена мечту". Огромноепреимуществоэтого методасостояло в том,что в отличиеот химическихметодов он"работает"от центра кпериферии.Иными словами,относительнотяжелый атомкобальта снаибольшейточностьюуказывал положениеближайших кнему атомов,а именно атомовмакрокольца.Когда работаприближаласьк завершению,оказалось, чтоединственнымиатомами, положениекоторых оставалосьнесколькосомнительным,были те, длякоторых онобыло выясненоФолкерсом иего сотрудникамив результатеизучения продуктовокислениявитамина. Вычисления,относившиесяк самому витаминуB₁₂, были на времяотложены, когдаисследователисмогли получитькристаллическуюгексакарбоновуюкислоту. Этоболее простоесоединениенеожиданнолегко поддавалосьрентгеноструктурномуанализу, в связис чем и былидостигнутыбольшие успехи.К счастью, основныеструктурныеособенностиэтого веществаи самого витаминаоказалисьидентичными,так что исследованияэтих веществвзаимно дополнялидруг друга.Однако они вобоих случаяхнезависимопривели к весьмаредкой структуремакрокольца.Макрокольцосодержит 4восстановленныхпиррольныхкольца с прямойα-α-связьююмежду кольцамиА и D. Дальнейшиеуточнения врасчётах сделалисьвозможнымив результатеизучения двухкобаламинов,содержащихотносительнотяжелые атомы,а именно производныхтиоцианатаи селеноцианата;позже для этойже цели былиспользовананалог витаминаB₁₂, содержавшийдва атома хлорана месте метильныхгрупп у бензиминазола.Наконец, выясниласьприрода боковыхцепей, и можнобыло почти сполной уверенностьюнаписать всюструктурнуюформулу. Всеоставшиесясомнения были,по-видимому,разрешеныдальнейшимивычислениями,позволившимидаже установить,что в макрокольце6 двойных связей.

Устойчивость

Влитературенакопилосьмного данныхоб устойчивостивитамина B₁₂к действию какреактивов, таки лекарственныхпрепаратов;многие из этихданных можнотеперь истолковать,исходя из строенияи реактивностиразличныхчастей молекулывитамина.Кристаллическийцианкобаламинв твердом состоянииустойчив дажепри действиитемпературы100° в течениенесколькихчасов. По Березовскому,при нагреваниикристаллическогоцианкобаламинапри 100° происходитмедленноеразложение.В водных растворахон наиболееустойчив прирН от 4 до 6 (поБерезовскомудо 7); в этих пределахрН растворыможно стерилизоватьавтоклавированиемпри 120° с потерейлишь несколькихпроцентовактивности.При pH 9 происходитбыстрое разложение(примерно 90% всутки).

Аквокобаламинменее устойчив,особенно вщелочном растворе,но оба веществаинактивируютсяпримерно на90% в течение 1 часапри 100° при рН8. Нагреваниев сильно щелочномрастворе использовалидля количественногоразрушениявитамина B₁₂с целью контроляпри некоторыхметодах микробиологическогоопределенияактивности.Однако в неочищенныхпрепаратахнекоторыевосстанавливающиевещества могутоказыватьзащитное действие.Нейтральныеили слегкакислые растворывитамина B₁₂при комнатнойтемпературев темноте сохраняютсягодами, тольков очень сильноразведенныхрастворах идетмедленныйгидролиз собразованиемнебольшихколичествфактора В. Всильно кислыхи, особенно вщелочных растворахпри комнатнойтемпературепроисходитмедленныйгидролиз докарбоновыхкислот. На светуцианид медленноотщепляетсяи образуетсяоксикобаламин,но при выдерживаниираствора втемноте происходитобратный процесс.Длительноевоздействиесолнечногосвета ведетк необратимомуразрушению.Характер действиявосстановителейне всегда можнопредсказатьс уверенностью.Утверждают,что тиоловыесоединенияв низких концентрацияхзащищают витаминот разрушения,и их даже используютиногда с этойцелью примикробиологическихопределениях,однако в большихколичествахони сами могутвызвать разрушениевитамина. Сульфиттакже рекомендовалиприменять длязащиты Кобаламинов,особеннооксикобаламина.Аскорбиноваякислота действуетне так, как другие,восстановители.Она довольнобыстро разрушаетвитамин B_12b, нопочти не действуетна витамин B₁₂.Данное наблюдениеиспользовалипри анализесмесей этихдвух веществ,но такой методпригоден лишьдля сравнительночистых растворов.В печеночныхэкстрактахсодержитсязащитный фактор,которым оказалосьжелезо; другиеметаллы, напримермедь, катализируютреакцию. В сухихлекарственныхпрепаратахвитамин B₁₂устойчив прирастираниив порошок схлористымнатрием илис маннитом.Растворы можностабилизироватьфенолом, подвергнутымдвойной перегонке,хотя примеси,содержащиесяиногда в феноле,могут вызыватьразрушениевитамина. Совместноеприсутствиетиамина (витаминаB₁) и никотинамида(или никотиновойкислоты) ведетк медленномуразрушениювитамина B₁₂в растворе.Железо защищаетвитамин В₁₂от взаимодействияс никотиновойкислотой.

Механизмдействия

Недостатокв пище витаминаB₁₂ приводитк макроцитарноймегалобластическойанемии. Нарушаетсяработа нервнойсистемы, наблюдаетсярезкое снижениекислотностижелудочногосока. Впрочем,авитаминозВ₁₂ может развитьсядаже при полноценномпитании, т. к.для процессавсасываниявитамина втонкой кишкеобязательноналичие в желудочномсоке особогобелка – гастромукопротеина(фактор Касла).В полном соответствиис буквальнымпереводомсвоего латинскогоназвания, этотбелок выделяетсястенками желудка,теми же клетками,которые выделяюткислоту. ФакторКасла специфическисвязываетвитамин В12. Точнаяроль этогофактора невыяснена. Полагают,что в составекомплекса сгастромукопротеиномвитамин всасываетсяв тонком кишечникеи поступаетв кровь портальнойсистемы в комплексес транскобаламинамиI и II, приэтом факторКасла гидролизуется.

Когдабиохимикипривыкли кмысли, что витаминВ₁₂ не простоспецифическийантипернициозныйфактор, а одиниз витаминовгруппы В, онистали предполагать,что он подобнодругим водорастворимымвитаминамокажется кофакторомпо крайней мерев одной ферментнойсистеме. Новопреки ожиданиюфункции, приписываемыевитамину B₁₂различнымиисследователями,оказались стольмногочисленнымии разнообразными,что трудно былопредставитьсебе, как всеони могли бытьсвязаны с такойролью кофактора.Поэтому сталиискать егоосновную функцию.Например, казалосьвероятным, чтоон каким-тообразом ответственза поддержаниесульфгидрильныхсоединенийв восстановленномреактивномсостоянии; онмог бы, скажем,"активировать"различныеSH-ферменты,препятствуяих окислениюв неактивныеS-S-формы. Или еслион связан ссинтезом белка,он был бы необходимдля синтезабелковой части(апофермента)ряда ферментов.

Позднейшиеисследования,особенно сприменениемизотопов, поставилипод сомнениенекоторые изприписываемыхвитамину В₁₂функций и выдвинулина первый пландругие. Однакоряд новейшихрезультатовеще не подтвержден.

Отношениек сульфгидрильнымферментам

Влияниеконцентратавитамина B₁₂на восстановлениенекоторыхS-S-соединенийв SH-форму изучалв o1950 г. Дубнов наферментныхсистемах in vitro. Онвысказалпредположение,что восстановлениемгомоцистинав гомоцистеин,легко присоединяющийметильнуюгруппу, можно,было бы объяснитьдействие витамина B₁₂ на синтезметионина.Поддержаниеглутатионав восстановленноммсостоянии моглобы играть рольв активацииSH-ферментов.Эти гипотезыбыли подкрепленыпоследующиминаблюдениями.При рецидивахпернициознойанемии, а такжеу крыс, получающихрацион с недостаткомвитамина В₁₂концентрациясульфгидрильныхсоединений(главным образ6мглутатиона)в крови ниженормальной,и в обоих случаяхона поднимаетсядо нормы илипосле введениявитамина. Быстротаэтой реакциипозволяетдумать, что этонепосредственныйрезультатдействия витамина.Однако Жаффевовсе не обнаружилподобногодействия умышей.

СогласноЛингу и Чоу идругим авторам,при авитаминозеВ₁₂ нарушеноиспользованиеуглеводов. Этомогло бы бытьсвязано с низкойконцентрациейглутатионадвояким образом.Сульфгидрильныегруппы некоторыхгликолитическихферментов моглибы окислятьсядо неактивнойS-S-формы: в частности,глутатионявляетсяпростетическойгруппой одногоключевогофермента –глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.Позднее Дубновподверг дальнейшейпроверке своюгипотезу реактивацииSH-ферментов,использовавпокоящиесяклетки мутантаЕ. coli, нуждающегосяв витамине B₁₂.Он нашел, чтоактивностьряда такихферментоввначале былатак же высока,как и в клетках"дикого" штамма,но снижаласьпо мере старениякультур и моглабыть вновьповышена добавлениемвитамина B₁₂или глутатиона,причем гораздоэффективнеебыло добавлениеих обоих.

Обмен жирови каротина

Благотворноедействие витаминаВ₁₂ на обменжиров у животныханалогичнымобразом приписывалиподдержаниюкоферментаА в активномвосстановленномсостоянии. Укрысят, получающихрацион с недостаткомвитамина B₁₂,организм неспособенсинтезироватьжиры, а у взрослыхкрыс нарушаетсяиспользованиежиров пищи такчто животныестановятсятучными в результатеизбыточногонакопленияжира. Полагают,что этот эффектлишь частичнообъясняется,действиемвитамина B₁₂на синтез метионина,в результатекоторого, всвою очередь,увеличиваетсяколичестволипотропныхвеществ – холинаи бетаина.Установлено,что витаминB₁₂ повышаетвсасываниекаротина илипревращениеего в витаминА у крыс (на чтоуказываетповышенноенакоплениепоследнегов печени); хотяи не влияет нанакоплениеготового витаминаА. Механизмэтого действияеще неясен.

Участиевитамина B₁₂в биохимических

восстановительныхпроцессах

Утверждали,что витаминВ₁₂ помимодействия насульфгидрильныесоединенияподдерживаетв восстановленномсостояниидругие важныевещества. Так,Уилл и сотр.установили,что в плазмебольных пернициознойанемией содержаниеаскорбиновойкислоты понижено;кроме того, приинъекции такимбольным аскорбиновойкислоты онабыстро окисляетсяв дегидроаскорбиновую.После лечениявитамином B₁₂эти явленияисчезают, аинъекции аскорбиновойкислоты ведутк повышениюее концентрациив плазме. Чоуи сотр. нашли,что в печеникрыс с недостаточностьювитамина В₁₂общее содержаниедифосфопиридиннуклеотидаповышено, ноколичествоего восстановленнойформы (ДПН-Н)понижено. Ненормальновысокое отношениеДПН/ДПН-Н снижалосьвдвое послевведения витаминаB₁₂.

Быловысказанопредположение,что витаминB₁₂ способениграть рольвосстановителя,когда еготрехвалентныйкобальт восстановлендо двухвалентногосостояния.Однако нужнысильные восстановители,чтобы вызватьэту реакцию,которая в присутствииатмосферногокислорода идетв обратномнаправлении.Предположениео том, что соединениес белком моглобы сдвинутьокислительно-восстановительныйпотенциал вобласть физиологическихвеличин, невполне убедительно,так как способностьсвязывать белокпосле восстановления,возможно,утрачивается.

Биосинтезметионина исерина

Метилкобаламинучаствует вреакциях синтезаметионина вкачестве кофактора.Заключительнымэтапом синтезаметионина убактерий, грибов,высших растенийи животныхсостоит в переносеметильнойгруппы от СН₃-ТГФКк сульфгидрильнойгруппе гомоцистеина.

Существуетдва типа ферментов,осуществляющихсинтез метионина– первый, независимыйот кобаламинов,может использоватьв качестведонора метильнойгруппы толькотриглутаматнуюформу СН₃-ТГФК.Второй типферментов,зависимый откобаламиновыхкофакторов,может использоватькак моно-, таки триглутаматнуюформу СН₃-ТГФК.Для активацииферментоввторого типа,кроме того,требуетсяS-аденозилметионин(S-AdoMet).Последнийнеобходим дляпервоначальногометилированиякобаламина.

Схема 1. Биосинтезметионина.

МутантЕ. coli, используемыйдля определениявитамина В₁₂,способен также хорошо растии при добавлениик минимальнойпитательнойсреде метионина,только дляоптимальногороста требуетсяпримерно в10000 раз большеметионина, чемвитамина. Очевидныйвывод, что вклетках этогоорганизмавитамин действуеткак катализаторсинтеза метионина,был подтвержденэкспериментально.Однако длялюбого другогомикроорганизма,нуждающегосяв витамине B₁₂,этот витаминне может бытьзаменен метионином,так что он, очевидно,осуществляету этих организмовкакую-то дополнительнуюфункцию.

Скармливаемыйпредшественник	Радиоактивностьметильногоуглеродаметионина, μс/г-атом		Повышениебиосинтезаметионина, %
	В присутствиивит. В12	В отсутствиевит. В12
Принеограниченномпотреблениипищи
α-14С-Глицин(2%) β-14С-Серин(0,7%) 14С-Формиатнатрия (0,1%)	156 81,5 33,8	95,5 47,4 20,0	63 72 69
При ограниченномпотреблениипищи
14С-Формиатнатрия (0,1%)	32,0	28,6	12

Таблица 1.Влияние витаминаВ12 на биосинтезметионина.

Р

Схема 2. Этапыпереноса радикалас одним углеродныматомом.

анние экспериментыс изучениемроста цыпляти крыс такжепоказали, чтовитамин B₁₂снижает потребностьв метионине,особенно привведениигомоцистеина.Сначала этобыло истолкованокак действиевитамина натрансметилирование,т. е. на передачулабильнойметильнойгруппы от холинаили бетаинак гомоцистеинус образованиемметионина.Точно так жевитамин B₁₂может, по крайнеймере частично,заменять холиндля цыплят,крыс и поросят-сосунков.Ряд исследований(некоторые изних с использованием¹⁴С) показал,что витаминB₁₂ не оказываетникакого влиянияна трансметилирование,но участвуетв прямом синтезелабильнойметильнойгруппы из болееокисленныхпредшественников– таких, какформиат, α-углеродглицина илиβ-углерод серина.Трудностиистолкованиярезультатов,получаемыхна интактныхживотных, хорошоиллюстрируеттаблица 1.

П

риавитаминозеВ₁₂ сильноухудшаетсяаппетит и наблюдаемыерезультатычасто могутбыть обусловленыпросто пониженнымпотреблениемпищи по сравнениюс контрольнымиживотными. Этунеясность можноустранить,ограничивпотреблениепищи контрольнымиживотными доуровня, х

Схема 3. Этапыпревращениягомоцистинав метионин.

1 –Гомоцистин;2 – Гомоцистеин;3 - Метионин

арактерногодля авитаминозныхживотных (метод"парного кормления").Подтверждениеданных дляпоросят и цыплятв опытах с¹⁴С-формиатоми ¹⁴С-сериномполучили Джонсони сотр. Однакопри использованиимеченогоформальдегидарезультатоказался неожиданным:интенсивностьвключения меткив метильныегруппы метионинаи холина у цыплятс недостаточностьювитамина B₁₂оказаласьзначительноповышенной.Есть основательныеданные в пользутого, что новообразованныеметильныегруппы появляютсяв метионине,но потом в результатетрансметилированияони могут оказатьсяв холине иликреатине. Этивыводы никтоне оспаривал,но некоторыеисследованияпозволялипредположить,что, кроме того,при недостаточностивитамина B₁₂у крыс активностьтрансметилазыв печени понижена.

Значениевитамина B₁₂в переносегрупп с одниматомом углеродапочти неразделимопереплетаетсяс функциямифолиевой кислоты(точнее, производныхтетрагидрофолевойкислоты). Этипроцессы переноса,которые могутпроисходитьна трех различныхуровнях окисления,схематическипредставленына схеме 2, показанытакже связанныес ними реакцииокисления ивосстановления.Некоторые изэтих процессовпереноса происходятв несколькоэтапов (не показанныхна схеме 2) это,безусловно,относится кпревращениюгомоцистинав метионин, ипочти нет сомнений,что для реакциив целом необходимыоба витамина.Возможнаяпоследовательностьэтапов показанана схеме 3.

Как ужеговорилось,витамину B₁₂приписывалиучастие ввосстановлениигомоцистинадо гомоцистеина– акцептораметильнойгруппы. Однакопоследующиеопыты с меченымиаминокислотамипоказали, чтовитамин, возможно,не нужен дляэтого восстановления.Какое-то производноефолиевой кислоты,несомненно,участвует всамом переносерадикала содним углеродныматомом. Тогдаединственнаяфункция, остающаясядля витаминаB₁₂, состоит ввосстановленииэтой группыв метильнуюгруппу метионина– если тольковитамин недействует лишькосвеннымобразом, способствуя,например, синтезуферментов. Вовсяком случае,синтез метионинане может бытьединственнойбиохимическойфункцией витаминаВ₁₂ у высшихживотных, такони гибнут отего недостаточностидаже при большомколичествеметионина ихолина в пище.

Сопоставлениеданных, приводимыхв пользу и противучастия витаминаB₁₂ во взаимопревращенияхглицина и серина,приводилоскорее к выводуоб отсутствиивлияния витамина,но работа Вораи сотр. вскрылановую сторонупроблемы. Этиавторы не обнаружилиснижения общегосинтеза серинаиз α-¹⁴С-гли-цинав срезах печенииндейки, нонаблюдализначительноеуменьшениевключения ¹⁴Св положении3. Они объясняютэто тем, чтовитамин B₁₂действует наэтапе отщепленияот глицинарадикала содним углеродныматомом, переноскоторого осуществляеттетрагидрофолеваякислота. Еслиэто подтвердится,то, по-видимому,такой же механизммог бы действоватьв синтезе метильнойгруппы метионинаde novo.

Такжепо механизмутрансметилированияу некоторыхбактерий происходитсинтез уксуснойкислоты и метана:

Синтезнуклеиновыхкислот

С самогоначала работв данной областисчитали почтинесомненным,что витаминB₁₂ стимулируетсинтез дезоксирибонуклеиновойи, вероятно,рибонуклеиновойкислот. Молочнокислыебактерии,используемыедля определениявитамина B₁₂,почти так жехорошо растутпри замене егобольшими количествамитимидина илидругих дезоксирибонуклеозидов;проще всегоэто можно объяснитьтем, что витаминB₁₂ участвуетв каком-то этапесинтеза ДНК.Выяснилось,что действиевитамина связанос синтезомдезоксирибозногокомпонентаДНК. Некоторыеученые полагают,что у некоторыхбактерий витаминB₁₂ стимулируетсинтез не толькоДНК, но и РНК.

Однакодругие микроорганизмы,нуждающиесяв витамине B₁₂,не способнырасти на дезоксирибозидах,и нет данныхо том, что у этихвидов витаминконтролируетсинтез ДНК. Умутанта Е. coliравномерномеченный уридинпревращалсяв тимин не тольков присутствиивитамина B₁₂,но и в присутствииметионина;кроме того, унего не наблюдалосьпревращениямеченой рибозыв дезоксирибозид.Тем не менеебыла тенденцияпереноситьвыводы из опытовс молочнокислымибактериямитакже и на высшихживотных, включаячеловека. Этомуспособствовалфакт энергичнойрегенерацииэритроцитови роста эпителияязыка послелечения рецидивовпернициознойанемии цианкобаламином.Здесь действительнодолжен происходитьбыстрый синтезнуклеиновыхкислот, но возможно,что этот процессподавляетсяпри недостаточностивитамина, таккак для пролиферацииклеток необходимыи другие компоненты.Кроме того,активностькостного мозгапри пернициознойанемии отнюдьне подавлена;в самом деле,кругообороткомпонентовгема примерновтрое превышаетнормальныйуровень, нобольшая частьэтой активностибесполезнадля образованияновых эритроцитов.Ряд исследователейотмечает пониженноесодержаниеДНК, РНК илиобеих нуклеиновыхкислот в организмеживотных приавитаминозеВ₁₂; истолкованиетаких результатовусложняетсятем, что авитаминозныеживотные потребляютменьше пищи.О`Делл и Бруммериспользовалирадиоактивныйфосфат и нашли,что лишениекак витаминаB₁₂, так и пищивообще действительнооказываетсходное влияниена синтез нуклеиновыхкислот. Глейзери сотр. установили,что в мегалобластическомкостном мозгечеловека отношениеурацил/тимини соответственноотношениеРНК/ДНК значительновыше нормального.После лечениявитамином B₁₂или фолиевойкислотой обевеличины быстроуменьшалисьдо нормы. Предложенноеобъяснениесостояло в том,что витаминB₁₂ катализируетсинтез компонентаДНК – тимина;метилированиеурацила собразованиемтимина формальноаналогичнометилированиюгомоцистеинас образованиемметионина –реакции, которую,как известно,стимулируетвитамин B₁₂.Однако в этомисследовании,к сожалению,определялиотносительные,а не абсолютныеколичества,между тем болееранняя работаДэвидсона иуказывает навозможностьиного объяснениярезультатов.Эти авторынашли, что вмегалобластическомкостном мозгесодержаниеДНК и особенноРНК ненормальноповышено врасчете какна 1 г, так и на1 клетку; послелечения количествообеих кислотуменьшалось(правда, количествоРНК - быстрее),что и должнобыло вести кизменениюотношений,найденномуГлейзером иего сотрудниками.

Введенныйпредшественник	Радиоактивностьвыделенных нуклеиновыхкислот,имп/мин/мг
	Полноценныйрацион		Рацион,лишенный вит.В12
	РНК	ДНК	РНК	ДНК
	У свиней
14С-Формиат 14С-Серин 14С-Глюкоза	360 266 255	316 232 260	318 266 230	356 226 235
	У кур
14С-Формиат 14С-Формальдегид 14С-Глицин 14С-Серин 14С-Н3-Метионин	680 590 460 308 440	605 482 328 325 360	625 470 388 330 409	582 505 305 330 320

Таблица 2.Влияние витаминаВ12 на синтезнуклеиновыхкислот.

Позжев опытах с изотопамистали искатьболее прямыхданных. Исследовали,например, влияниевитамина B₁₂на включениерадиоактивногофосфора в нуклеиновыекислоты. ВитаминB₁₂ стимулировалвключение егово фракцию ДНКкишечника иселезенки, ноне печени и вто же время невлиял на радиоактивностьРНК. Джонсони сотр. использовалиеще более прямойподход к проблеме:они изучаливключение ¹⁴Сиз различныхпредшественников(формиата,формальдегида,глицина, серинаи глюкозы) внуклеиновыекислоты печенисвиней, кур икрыс; у крысони определялитакже превращениенекоторых изэтих предшественниковв аллантоин.Ни в одном случаенельзя былообнаружитьсколько-нибудьзначительноговлияния витаминаB₁₂ на радиоактивностьДНК, РНК илиаллантоина.Если эти данныебудут подтверждены,то трудно будетпризнаватьсвязь междувитамином В₁₂и синтезомнуклеиновыхкислот у высшихживотных. Мистрии Джонсон вопытах на курахдействительноустановили,что витаминB₁₂ повышаетсинтез мочевойкислоты изформиата, метильнойгруппы метионинаили β-углеродногоатома серина,но не из формальдегидаили глицина;однако онитрактуют этоне как результатпрямого действияна биосинтезпуринов, а каквозможноевлияние накакую-то окислительнуюреакцию в обменесоединенийс одним углеродныматомом.

Белковыйобмен

Очевидно,что благодарясвоему влияниюна синтез метионинавитамин B₁₂оказываеткакое-то действиена белковыйобмен. Например,можно ожидать,что цианкобаламинбудет улучшатьиспользованиебелка из рационов,в которых этойаминокислотынедостаточно.Таким образомобъяснялинекоторые изотмеченныхвыше благотворныхэффектов витамина.Значительнуюприбавку в весетела, даже еслиона связанас увеличениемколичестване только жира(как часто бывает),но и белка, обычноможно объяснитьпросто повышеннымпотреблениемпищи животными,получающимивитамин B₁₂. Небыло обнаруженоникакого влияниявитамина B₁₂на баланс азотаи эффективностьиспользованиябелков у крыс.Различныеисследования,однако, указывалина более прямуюроль этоговитамина всинтезе белка.Так, было установлено,что у крыс сгипертиреозом(гиперфункциейщитовиднойжелезы) витаминB₁₂ способствуетудержаниюазота. У курпри недостаточностивитамина B₁₂концентрацияаминокислотв крови повышена,а белков в плазме– понижена; учеловека такжепоказано обратноеотношение междуконцентрациямиаминокислоти витамина B₁₂в крови, чтообъясняетсястимулирующимдействиемвитамина насинтез белков.Сообщаетсяоб избыточномвыведении смочой аминокислот,особенно лизина(но также и таурина)при обострениипернициознойанемии и дегенерацииспинного мозга.Нарушениенормальногообмена тирозинаи триптофанамогло бы вестик избыточномувыделениюфенольныхвеществ, тожеотмеченномупри пернициознойанемии, и, возможно,к образованиютоксичныхвеществ, вызывающихгемолиз, которыминогда сопровождаетсяэто заболевание;все эти обменныенарушениябыстро исчезаютпосле введениявитамина B₁₂.Было отмечено,что при дегенерацииспинного мозга,часто сопровождающейпернициознуюанемию, поражаютсянекоторыекрупные аксоны,нормальноесостояниекоторых поддерживаетсябыстрым обновлениембелка. Поэтомуисследователипредположили,что витаминB₁₂, специфическиизлечивающийэто состояние,косвеннымобразом контролируетсинтез белка;полагая, чтопрямое действиевитамина направленона синтез нуклеиновыхкислот, онисвязали своепредположениес гипотезойо том, что РНКслужит "шаблоном"для синтезабелка; их данныебыло бы логичнееистолковатьв пользу прямогодействия витаминаB₁₂ на синтезбелков.

Изучалосьвлияние витаминаB₁₂ на включениемеченого серинаили меченойглюкозы в белкипечени и в некоторыеотдельныеаминокислотыу свиней и крыс.Во всех опытахполученныевеличины былизаметно нижеу животных савитаминозом.Исследователиприводят соображенияв пользу того,что это не былоследствиемодного лишьпониженногопотребленияпищи. Данныенаблюдениябыли дополненыисследованиями,проведеннымиin vitro на препаратахмикросом изпечени и селезенкинормальныхкрыс и крыс савитаминозом.Как показано,между этимигруппами животныхобнаружилисьбольшие различияво включениимеченых аминокислот;кроме того, придобавлениивитамина B₁₂к препаратаммикросом, полученныхот животныхс авитаминозом,включениеаминокислотзаметно возрастало.

Ученыепошли дальшеи показали, чтов надосадочнойжидкости послецентрифугированиямикросом печенинаходитсясодержащийвитамин B₁₂«рН5-фермент»,катализирующийвключениемеченых аминокислотв белок. Интереснобыло бы выяснить,не обладаетли ферментативнойактивностьюкомплекс витаминаB12 с пептидом,выделенныйранее из печени.Позднее былопоказано, что«рН5-фермент»содержит большуючасть витаминаВ₁₂, первоначальнонаходившегосяв микросомахпечени. Этотфермент подверглидальнейшемуфракционированию;он, по-видимому,катализировалкак активациюаминокислотаденозинтрифосфатом,так и их последующеевключение вбелковую фракциюмикросом. Крометого, оба процессаподавлялисьантагонистамивитамина В₁₂содержащимиостаток анилидавместо однойиз амидныхгрупп. Исследователивысказалигипотезу, чтовитамин В₁₂-ферментдействует какактиватор-переносчик:он переноситаминокислоты(после активацииих карбоксильныхгрупп аденозинтрифосфатом)на "шаблон",возможно, путемтранспептидирования,в котором участвуют6 карбоксамидныхгрупп молекулывитамина. Некоторыеученые приводятсоображения,позволяющиепредполагать,что некоторыеиз карбоксамидныхгрупп являютсябиохимическиактивнымичастями молекулы.Другим исследователямпока не удалосьподтвердитьэти данные; ониуказываюттакже, что включениеаминокислотв белок микросомне обязательнопредставляетсобой нормальныйсинтез белка.Таким образом,эти результатынельзя считатьокончательнымдоказательствомпрямого действияцианкобаламинана белковыйсинтез. Однакоэто привлекательнаягипотеза; контролемсинтеза апоферментовможно было быобъяснитьвлияние витаминаВ₁₂ на ряд, казалосьбы, не связанныхмежду собойферментныхсистем. В пользуэтого можнопривести идругие данные;различныеисследователиутверждали,что недостаточностьвитамина B₁₂у крыс ведетк уменьшениюсодержанияв их печенинекоторыхферментов, аименно трансметилазы,рибонуклеазы,цитохромоксидазыи различныхдегидрогеназ.Другие авторыустановили,что при отсутствиивитамина B₁₂не происходитрегенерацииткани печенипосле частичнойгепатэктомии.Все эти данныеговорят в пользупрямого иликосвенноговлияния витаминана синтез белка.

Другиевозможныефункции

Недостатокцианкобаламинав пище ведетк повышенномувыделениютиоцианата;в связи с чембыла выдвинутагипотеза, основаннаяна предполагаемойлабильностигрупп цианидаи конкуренцииза цианид междуоксикобаламиноми ферментомроданезой.

Теснаявзаимосвязьмежду функциямифолиевой кислотыи цианкобаламинапривела кпредположениюо том, что последнийкатализируетпревращениефолиевой кислотыв "цитроворум-фактор"или какую-тодругую активнуюформу; убедительныхэкспериментальныхданных в пользуэтого, по-видимому,нет.

Интересныевзаимоотношения,видимо, существуюттакже междувитамином B₁₂и пантотеновойкислотой. Некоторыеисследователиутверждали,что в опытахс кормлениемкур каждый изэтих факторовснижал потребностьв другом. Эванси сотр. обнаружилиуменьшениесодержанияпантотеновойкислоты в печенипосле введениявитамина В₁₂курам с авитаминозоми предположили,что витаминмобилизуетпеченочныерезервы пантотеновойкислоты. Другиеисследователиподтвердилиэту взаимосвязьи отметилиповышенноесодержаниевитамина B₁₂в организмекрыс с недостаточностьюпантотеновойкислоты. Гершофи сотр. доказалиналичие взаимосвязимежду тироксином,магнием и витаминомB₁₂. Как магний,так и витаминB12 частично снимаютряд эффектоввведения тироксина,потерю витаминаB₁₂ тканями,подавлениероста, разобщениеокисления ифосфорилирования,изменениебелковых фракцийсыворотки. Этирезультатыеще ждут своегообъяснения.

«Концапути еще невидно, но естьоснованиянадеяться, чтоскоро мы будемзнать о механизмедействия витаминаB12 больше, чеммы знаем о действиинекоторыхдругих витаминов,открытых гораздораньше»

НекоторыеВ₁₂-зависимыеферменты

В12-коферментымногочисленныи различны. Ониотличаютсятем, что содержатдва типа лигандов:метильнуюгруппу и5`-дезоксиаденозин.

Превращениесвободноговитамина В12 вкоферментпроисходитв присутствииспецифическихферментов ипри участиив качествекофакторовФАД, восстановленногоНАД, АТФ и глутатиона.

Приобразовании5-дезоксикобаламиновогокоферментаАТФ подвергаетсянеобычномураспаду с отщеплениемтрифосфатногоостатка поаналогии среакцией синтеза5-аденозилметионинаиз метионинаи АТФ.

ВпервыеВ12-коферментыбыли выделеныГ. Баркером ссотрудникамив 1958 г. из микробов.

Химическиереакции с участиемВ12-коферментовподразделяютна две группы:реакции трансметилированияи изомеризации.В реакцияхпервой группыкоферментыиграют рольпромежуточныхпереносчиковметильнойгруппы. К такимреакциям относятся,например, синтезыметионина иацетата. Гомоцистеинпод воздействиемметилкобаламинаи тетрагидроилглутаматметилтрансферазыв присутствиивосстановленногоФАД и N⁵-СН₃-ТГФК^*превращаетсяв метионин.Метильнаягруппа N⁵-СН₃-ТГФКпереноситсявначале наактивный центрфермента, затемна гомоцистеин.Ко второй группереакций относитсяизомеризацияL-метилмалонил-КоАв сукцинил-КоА.

Диолдегидратаза

Приведемвначале важнейшиеданные, полученныеза последниегоды при исследованиидиолдегидратазы,т. е. фермента,катализирующегопревращениеэтандиола-1,2,и пропандиола-1,2,соответственно,в ацетальдегиди пропионовыйальдегиды.Оказалось, чтоодин и тот жефермент способенкатализироватьпревращениеи этандиола-1,2и пропандиола-1,2в соответствующиеальдегиды.Примечательнойособенностьюэтого фермента,как и всех остальныхаденозилкобаламин-зависимыхферментов,явилось то, чтоокончаниереакции сопровождаетсядеструкциейи высвобождениемкоферментаиз фермент-коферментногокомплекса.

Диолдегидратазапредставляетсобой белокс мол. массой250000 с единственнымактивным центромсодержащимаденозилкобаламин.Хроматографияпозволяетразделитьфермент на двесубъединицыс разнымимолекулярнымимассами. Каждаяиз субъединицнеактивна,рекомбинацияих приводитк восстановлениюактивности.Весьма важными, по-видимому,общим свойствомвсех аденозилкобаламин-ферментов,являетсячувствительностьдиолдегидратазык сульфгидрильнымингибиторам.Образованиетройного ферментногокомплекса (апофермент-АденозилКобаламин-пропандиол-1,2) полностьюзащищает ферментот действияртутьсодержащихингибиторов.Это позволяетутверждать,что HS-группа(или группы)фермента можетиметь большоезначение дляпроявлениябиокаталитическойактивности.Важно подчеркнуть,что защищающимдействием,помимо аденозилкобаламина,обладают идругие Кобаламины(CN-Кобаламин,метилкобаламин),введение которыхв ферментныйкомплекс вместокоферментаприводит к егоинактивации.Тем не менеерасщеплениетакого комплексапосле обработкиSH-соединениеми последующаяреконструкцияс аденозилкобаламиномвновь восстанавливаетактивность.Изучение химическоймодификацииэтого ферментавыявило большоезначение различныхаминокислотныхостатков вактивном центрефермента. Такоказалось, чтоодин остатокаргинина намоль ферментаявляется необходимымдля проявлениякаталитическойактивностидиолдегидратазы.Наконец, недавнобыло продемонстрированозначение другойосновной аминокислоты– лизина дляпроявленияферментативнойактивности.Остаток лизина,важный дляобеспеченияактивной олигомернойструктурыфермента исвязыванияаденозилкобаламина,локализованв низкомолекулярнойсубъединице.Остатки основныхаминокислотобеспечиваютионное взаимодействиемежду субъединицами.

Глицеролдегидратаза

Другойфермент, катализирующийпревращениявицинальныхгликолей вальдегиды –глицеролдегидратазаили глицеролгидролиазаответствененза изомеризациюглицерина вβ-оксипропионовыйальдегид ипродуцируетсякак некоторымиштаммами Klebsiellaр., так и Propionibactereciae.Кофакторами,необходимымидля проявленияактивностиглицеролдегидратазы,являютсяаденозилкобаламини К⁺. Очисткафермента изКl. р. привелак выделениюферментногокомплекса смол. массой188000, содержащегодве субъединицыразного размераи 1 моль аденозилкобаламинана 1 моль фермента.Меньшая субъединицас мол. массой22 000 в свою очередьраспадаетсяна два белкас мол. массойоколо 12 000. Самосборкасубъединицв ферментномкомплексепромотируетсясубстратом– глицерином,аденозилкобаламиноми ионом К⁺.Интересно, чтоион Na⁺ингибируетактивностьфермента и ниодна из субъединицпо отдельностине способнасвязыватьаденозилкобаламин.

Аналогичнодиолдегидратазе,глицеролдегидратазаингибируетсясульфгидрильнымиингибиторами,причем в опытахс обработкойсубъединици последующейсборкой былопоказано, чтоменьшая субъединицапосле обработкиеще сохраняет25% от первоначальнойактивности,в то время какбольшая полностьюее теряет.

Этаноламин-аммиак-лиаза

Фермент,осуществляющийпревращениеэтаноламинав ацетальдегиди аммиак –этаноламин-аммиак-лиаза– был описанв 1965 г., очищен ивыделен в гомогенномсостоянии в1968 г.

Этотаденозилкобаламин-ферментинтенсивноисследовалсяв работах Бэбиораи Ейбилиса.Итоги изученияфермента можносуммироватьследующимобразом: оказалось,что, в отличиеот диолдегидратазы,единственнымсубстратомэтаноламин-аммиак-лиазыявляется этаноламин.Позднее быловыяснено, чтоL-2-аминопропанолтакже можетпревращатьсяв пропионовыйальдегид иаммиак. Однакоэто превращениесопровождаетсянеобратимымрасщеплениемкофермента.При реакцииNH₂-гpyппaвсегда перемещаетсяот С2 к С1 (т. е. катому, с которымсвязана ОН-группа).В опытах с меченым¹⁸О Н₂О былопоказано, чтогидроксил приС1 всегда остаетсяв продукте. Темсамым был исключенмеханизм образованияацетальдегидачерез промежуточныйимин, гидролизкоторого обязательнопривел бы квключению меткив продукт.Наблюдаемыйво всехаденозилкобаламин-зависимыхреакциях переносводорода С1→С2был обнаружени в этой реакции.Опыты с энантиомерамимногократномеченого субстрата- 2-амино-[2²H,2³Н]-этаноласвидетельствовалио рацемизациипродукта(ацетальдегида).Несмотря нато, что прямыхдоказательствперемещенияNH₂-группыот С2 к С1 не былополучено, процесспревращенияэтаноламинав ацетальдегиди аммиак описываетсяпо аналогиис другими реакциями.

Ферментпредставляетсобой довольнобольшой белокс мол. массой520000. В пятимолярномрастворе гуанидин-НСlон диссоциирует– на субъединицыс мол. массой50000. Показано, чтофермент содержитдва независимыхактивных центра.Подобно диолдегидратазефермент активируетсяодновалентнымикатионами К⁺и NH₄⁺ иингибируетсясульфгидрильнымиингибиторами.

Аденозилкобаламин-зависимыемутазы

СледующуюгруппуАденозилкобаламин-ферментов,составляютмутазы, катализирующиеперегруппировкиуглеродногоскелета и приводящиек обратимымпревращениямсубстратовс разветвленнойцепью в соединенияс прямой цепью.Среди этихферментовхорошо изученыдва – глутаматмутазаи метилмалонил-СоА-мутаза.

Глутаматмутаза

Фермент,катализирующийпревращениеL-глутаматав L-трео-β-метиласпартат,был выделен,из Clostridium tetanomorphum.Показано, чтомногочисленныефотосинтезирующиемикроорганизмытакже содержатглутаматмутазу.Фермент, кромеаденозилкобаламина,нуждается вSH-соединении,однако, в отличиеот диолдегидратази других аналогичныхферментов, дляпроявлениякаталитическойактивностине требуютсяодновалентныекатионы. Ферментвысокоспецифиченв отношенииструктурысубстратов.Ни аналогиглутаминовойкислоты, нианалогиβ-метиласпарагиновойкислоты (как,например,β-этиласпартат)не являютсясубстратамимутазы.

О

Схема 4. Схемадоказательстваналичия и ролиSH-группS-компонентаглутаматмутазы.

пыты поочистке ферментапозволилиустановитьсубъединичнуюструктуру иэтого аденозилкобаламин-зависимогофермента. Былиполучены вгомогенномсостоянии двесубъединицы,которые былиназваны S-и Е-белками.Каждый из белковне обладалпорознь активностью.Рекомбинацияих и взаимодействиес коферментомприводили квосстановлениюактивности.Первым былочищен Е-белок.Определениемолекулярноговеса показало,что это довольнобольшой белокс мол. массойоколо 128 000. В отличиеот ферментов,рассмотренныхвыше, добавлениеКобаламинане защищалоЕ-компонентглутаматмутазыот инактивациив растворе.Е-компонентсвязывал 1 мольаденозилкобаламина,а в присутствиисемикратногоизбытка S-компонентадополнительносвязывал ещеодин моль кофермента.

КомпонентS послеочистки, какоказалось,обладал намногоменьшей мол.массой 17000 и,по-видимому,содержал важныедля проявленияферментативнойактивностиSH- группы.ТитрованиеS-белкасульфгидрильнымиреагентамипоказало, чтона 1 моль белкаприходитсяпять SH-групп.Примечательнойособенностьюкомпонентабыла его способностьк димеризациив присутствииО₂. Расщеплениедимера осуществлялосьобработкойпоследнегокаким-либоRSH-соединением.Это свидетельствовалооб образованиимежмолекулярногодисульфидногомостика. ИнактивацияS-белка спомощью AsO₂^-доказываланаличие в активномцентре по крайнеймере одной издвух вицинальныхтиольных групп.ПревращениеSH-группS-белкапредставленына схеме 3.

Метилмалонил-СоА-мутаза

Другойаденозилкобаламин-зависимыйфермент, осуществляющийперегруппировкууглеродногоскелета метилмалонил-СоАв сукцинил-СоАбыл также сначалавыделен измикроорганизмов,а затем из тканеймлекопитающих.Оказалось, чтоэтот кобаламин-зависимыйфермент выполняетметаболическиважную рольна пути превращенияпропионил-СоАв сукцинил-СоА.Схема этогоучастка метаболизмавключает 3 фермента:биотин-зависимуюкарбоксилазу,рацемазу,превращающуюD-метилмалонил-СоАв L-изомер ирассматриваемуюкобаламин-мутазу.После очисткиметилмалонил-СоА-мутазыоказалось, чтоэто субъединичныйфермент с мол.массой 124000, расщепляющийсяна два компонентас мол. массой61 000 и 63000. Выделеннаяиз печени овцыметилмалонил-СоА-мутазапредставляетсобой окрашеныйв оранжевыйцвет белок смол. массой165000. Фермент связывал1 моль аденозилкобаламинна 75000.

Рисунок 8.Превращение

метилмалонил-СоАв сукцинил-СоА.

2-метиленглутаратмутаза

С

Схема 5. Схемапревращенияпропионил-СоАв сукцинил-СоА

ледующийсходный подействиюАденозилкобаламин-зависимыйфермент-это2-метиленглутаратмутаза,катализирующаяобратимоепревращениемежду 2-метиленглутаратоми 2-метилен-З-метилсукцинатом.Фермент былвыделен измикробиологическихисточниковпри выращиванииClostridium на средах,содержащихникотиновуюкислоту. Определениемолекулярноймассы частичноочищенногопрепарата даловеличину 170000.Обработкайодацетатомприводит кпотере активности,что, очевидно,свидетельствуето наличии важныхдля катализаSH-групп. ДействиеAsО₂^-, однако,не выявилоприсутствиявицинальныхдитиольныхгрупп.

Ферменты,трансформирующиеα, ω-диаминокислоты

Еще однагруппааденозилкобаламин-зависимыхферментов былавыявлена приисследованиимикроорганизмов,растущих наL-лизине.Эти ферментыкатализировалиперенос NH₂-гpyппыот концевогоуглеродногоатома в диаминокислотахк соседнемуатому углерода.Недавно описанаденозилкобаламин-зависимыйфермент, которыйосуществляетперенос NH₂-группыиз α- в β-положениеаминокислотылейцина.

Рассмотримболее подробноаденозилкобаламин-зависимыеферменты,трансформирующиеα, ω-диаминокислоты.Эти ферментывыделены изразличныхштаммов Clostridium.

Важно,что все трифермента ввысшей степениспецифичныдля каждогоиз субстратов.Замена субстратадля данногофермента насубстратыдругих аминомутазне позволяетосуществлятьперенос аминогруппы.

D-α-Лизинмутазавыделена изС. sticklandi, мол. масса250000. В процессеочистки ферментане происходилоотщепленияаденозилкобаламина,что свидетельствуето большой прочностисвязи комплексаапофермент-кофермент.Аналогичноот L-β-лизинмутазыв процессеочистки аденозилкобаламинтакже не отделялся.Это тетрамерныйфермент с мол.массой 160000; егосубъединичнаяструктура былаподтвержденапосле того, какудалось выделитькомпонентыс мол. массой32000 и 52000. Оказалось,что для обеспечениянормальнойкаталитическойактивностиобеих мутазнеобходим белокс мол. массой60000. Как видно,аминомутазысохраняютспособностьзащищать вполностьюреконструированномвиде важныедля биокатализаSH-группы. Этосвойство характернодля большинстваАденозилкобаламин-ферментов.

Орнитинмутазатакже представляетсобой ферментс прочно связаннымаденозилкобаламином,который неотщепляетсяпри очистке.Очищенныйфермент имелмол. массу 170 000 идиссоциировална две субъединицыс мол. массой90000. Этот ферментне требовалдля своей активациикакого-либоSH-белка, однакосам содержалважные длябиокатализаSH-группы, вследствиечего ингибировалсяпод действиемтиоловых ингибиторов.

Заслуживаетособого вниманияпрочность, скоторой связанаденозилкобаламинво всех трехферментах. Приобработке ихвнутреннимфактором ферментыинактивировались.Сравнительноеисследованиетрех аминомутазпоказало, чтов дополнениек аденозилкобаламинудля проявленияих активноститребуются: дляD-α- и L-β-мутаз ионыMg²⁺ и одновалентныекатионы, причемдля D-α-лизинмутазы-этоК⁺, Rb⁺ и NH₄⁺(фермент ингибируетсяпри добавленииNa⁺ и Li⁺). L-β-лизин-мутазав разной степениактивна в присутствииLi⁺, Na⁺, К⁺, Rb⁺,Cs⁺ и. NH₄⁺. Дляпроявленияактивностиорнитинмутазыдобавленияионов металловвообще не требуется.

Поразительноеотличие аминомутазот всех остальныхкобаламин-зависимыхферментовсостоит в том,что вторымобязательнымкоферментомдля них являетсяпиридоксальфосфат,который обеспечиваетперенос ω-NH₄-гpyппыв форме пиридоксаминаили пиридоксальдимина.Очищеннаяорнитинмутазанеактивна дотех пор, покак реакционнойсмеси не будетдобавленпиридоксальфосфат(PLP). Очевидно, чтоPLP входит в активныйцентр ферментаи, по-видимому,связан в видеоснования.Шиффа с ε-NН₄-группойостатка лизинабелка.

Рибонуклеотидредуктаза

Рибонуклеотидредуктаза- фермент, катализирующийконверсиюрибонуклеотидовв 2`-дeзoкcиpибoнyклeoтиды.Этот фермент,имеющий ключевоезначение длябиосинтезаДНК у большинстваживых организмов,представляетсобой железо-протеиновыйкомплекс, независящий откорриноидов.Однако рядмикроорганизмови различныеEuglenophyt содержатрибонуклеотидредуктазу,коферментомкоторой являетсяаденозилкобаламин.Оказалось, чтофермент состоитиз одной полипептиднойцепи с мол. массой76000. Субстратомдля рибонуклеотидредуктазыявляютсярибонуклеозидтрифосфаты.Для очищеннойрибонуклеотидредуктазынеобходимымикофакторами,кроме аденозилкобаламина,являются тиолы.

ВитаминВ₁₅

Получениеи аналоги витаминаВ₁₅

Впервые,как уже былоупомянуто вовведении, витаминВ₁₅ был обнаруженв экстрактепечени быка.

Пангамоваякислота представляетсобой эфирD-глюконовойкислоты идиметилглицинас молекулярноймассой 281.

(СH₃)₂NCH₂COOCH₂(HCOH)₄COOH

П

Рисунок 9.Пангамат кальция.

олучают пангамовуюкислоту следующимидвумя способами:

1. ВзаимодействиемD-глюконолактонас монохлоруксуснойкислотой ипоследующейобработкойпродуктовреакции диметиламином.

2. Этерификациейглюконовойкислоты сдиметилглицином.(выход около25%)

Пространственноестроение молекулывитамина В₁₅изображенона рис. 9 (Приведеностроение пангаматакальция, соли,применяющейсяв терапевтическихцелях)

Аналогамивитамина В₁₅можно считатьряд соединений,представленныхна рис. 10, так какво всех этихсоединенияхметильнаягруппа лабильна,что и обуславливаетбиохимическиесвойства витаминаВ₁₅.

Механизмдействия

Потребностьв витамине В₁₅(по Кребсу, данныеот 1951 г.) составляетменее двух мг.в сутки. Однакопринадлежностьпангамовойкислоты к витаминамне доказана,в частностине существуетдостоверныхсведений обавитаминозахили гипервитаминозах,связанных сэтим соединением.Предпринималисьпопытки определитьтоксичностьпангамовойкислоты в связис ее широкимприменениемв терапии.Выяснилось,что токсическаядоза для витаминаВ₁₅ приблизительнов 100000 раз превышаеттерапевтическую,т. е. вещество,фактически,безвредно.

Есликобаламиновыеферменты являлисьв реакцияхтрансметилированияпереносчикамиметильнойгруппы, то пангамоваякислота, судяпо всему, выступаетв этих реакцияхв качестведонора одноуглеродногорацикала.

Лишьнемногие веществаспособны передаватьСН₃-группудругим молекулам.Среди них метионин,холин, бетаини некоторыенезаменимыеаминокислоты.

В целомкажущаясяуниверсальностьбиологическогодействия витаминаВ₁₅ (см. раздел«Клиника»)обусловленаметилирующейспособностьюпангамовойкислоты и ееактивностьюв окислительныхпроцессах.

К

Рисунок 10.Гомологи пангамовойкислоты.

а)Глюконодиметиламиноацетатб) Глюконодиизопропиламиноацетатв) D-глюконотри-(N-диизопропиламино)-ацетатг) Глюконо-бис-(диизопропиламино)-ацетат

ак и витаминВ₁₂, пангамоваякислота принимаетучастие в реакцияхсинтеза метионина,холина, креатина,адреналина,стеринов истероидныхгормонов.

П

отеории Борсукаи Дубнова синтезкреатина проходитв две стадии.На первой стадии,которая проходитв почках, изаргинина иглицина образуетсягуанидиноуксуснаякислота, затемв печени гуанидиноуксуснаякислота подвергаетсяметилированию(вторая стадия).Последовательностьсинтеза креатинабыла подтвержденаопытами с изотопамив работах Блохаи Шенгеймера(Bloch, Shoengheimer,1941) и ряда другихисследователей.

Б

орсуки Дубнов в опытахin vitroустановиливысокую специфичностькреатинсинтезирующейсистемы к метильномудонору (из 30испытанныхаминов в реакциювступили лишьметионин ихолин).

Способностьпангамовойкислоты заменятьв реакцияхтрансметилированиятакой классическийдонор метильнойгруппы, какметионин, вызываету исследователейбольшой интерес.

Предположительнохарактернымидля пангамовойкислоты являютсяреакции окислительногодеметилирования,протекающиеаналогичноподобной реакциисаркозина.

Образующийсяформальдегидиспользуетсязатем в реакциисинтеза серинаили конденсируется– в зависимостиот условийферментативногопроцесса.

Описанныйпроцесс начинаетсяпереносом атомаводорода ссаркозина (илидиметилглицина)на саркозиндегидрогеназу(соотв., диметилглициндегидрогеназу),затем атомводорода передаетсяфлавопротеину,через негоферментамдыхательнойцепи (цитохромыb, c, a,a₃) и, наконец,кислороду.Стимуляциявитамином В₁₅тканевогодыхания обусловлена,по всей видимости,именно этимпроцессом.

Клиника

ВитаминВ₁₂

В качествеиллюстрациишироты клиническогоприменениявитамина В₁₂можно привестивыдержку из«Инструкциипо применениювитамина В₁₂»,утвержденнойфармакологическимкомитетомУченого советаМинздрава СССР29 июня 1955 года:

«ВитаминВ₁₂ представляетсобой кристаллическоевещество красногоцвета, обладающеевыраженнымкроветворнымдействием вничтожно малыхдозах. Применениепоказано приследующихзаболеваниях:

1. БолезньАддисон-Бирмера,включая случаис нарушениемфункций нервнойсистемы

2. Спру (тропическаяи нетропическаяформы)

3. Мегалобластическаяанемия у детей

Рекомендуетсяиспытать^*:

1. Лучеваяболезнь

2. Гиперхромнаямакроцитарнаяанемия

3. Анемииканкрозные

4. Анемии послерезекции желудка

5. Анемииразличногопроисхожденияв предоперационномпериоде.

6. Анемиимакроцитарныегастроэнтерогенные

7. Острыехроническиегепатиты ициррозы печени

8. Токсическиеанемии»

Вопросо том, действуетли витамин В₁₂непосредственнона костныймозг, или егороль состоитлишь в активациифолиевой кислотыпутем переводаее в фолиновую.

В опытахАстальди, Вальдинии Фругони (1948),Томпсона (1952),Нивега (1953) с культурамитканей показали,что печеночныеэкстракты,также как ифолевая кислотав чистом виде,будучи добавленык культурекостного мозгабольных пернициознойанемией в стадииобостренияспособствуютускорениювызреваниямегалобластови появлениюнормобластов,в то время каккристаллическийвитамин В₁₂оказалсянеэффективен.

ВитаминВ₁₅

Пангамоваякислота выпускаетсяотечественнымифармацевтическимипредприятиямив виде кальциевойсоли (пангаматкальция). Онаактивируеткислородныйобмен, применяетсяпри острыхотравленияхалкоголем идругими наркотиками,при применениипрепаратовбарбитуровойкислоты, салицилатанатрия, ацетилхолина,кортизона, приотравленияххлорсодержащимиорганическимисоединениямии антибиотикамитетрациклиновогоряда. Проявляетлипотропный^*эффект.

Липотропноедействие проявилосьпри лечениигепатита ицирроза печени(алкогольного,сифилитическогои иного происхождения).Этот эффектвыражаетсяв снижениисодержанияальбуминови повышениидо нормы содержанияγ-глобулинов,усилении диуреза,увеличениисодержаниякреатина вкрови и моче,улучшенииобщего состояния:появлениибодрости, аппетита,нормализациисна, смягчениилокальныхсимптомов.Применениепангамовойкислоты такжестабилизируетдеятельностьсистемыгипофиз-надпочечникии центральнойнервной.

Активируеткислородныйобмен, участвуетв окислительныхпроцессах.Улучшает трофикусердечной мышцыв результатестимуляциибиосинтезакреатина икреатинфосфатаи активацииферментовдыхательнойцепи. Оказываетположительноевлияние прикислородномголоданиитоксическойприроды. Существенноповышает активностьдегидразы принекоторомснижении активностицитохромоксидазы(вышеупомянутыйцитохром а₃).Снижение активностицитохромоксидазысвязывают соснижениемнапряженностипереноса кислородачерез системуцитохром-цитохромоксидаза.(Функция последнейсводится ккатализу реакциимежду кислородоми восстановленнойформой последнегоцитохрома). А.В. Докукин, З.С. Константинова,Ю. С. Чечулин иЮ. В. Букин обнаружилиотчетливовыраженноезащитное действиепри локальнойгипоксии сердца:кошкам перевязывалилевую коронарнуюартерию. У техиз них, которымдавали заблаговременновитамин В₁₅аритмия и фибрилляциявозникали всреднем через10,6 минуты, в товремя как уконтрольныхживотных ужечерез 3,8 минуты.

Противотоксическоедействие пангамовойкислоты объясняетсяее вероятнымучастием вбиосинтезехолина, которыйсвязывает ивыводит токсическиевещества и/илистимуляциейокислениятоксическихсубстратов.Были полученыположительныерезультатыпри лечениибольных с хроническималкоголизмом(по мнению Н.К. Гудковой иЗ. Л. Синкевич,применениевитамина В₁₅способно заменитьтрадиционныйкурс лечения),различныминаркоманиями(кодеиномания,морфинизм,гашишизм идр.). Отмечаетсяисчезновениевлечения кнаркотику ирегресс соматическихизменений(цирроза,сердечно-сосудистыхзаболеваний,гепатита).

Существуетопыт примененияпангамовойкислоты у детейс олигофрениейв стадии выраженнойдебильности.Лишь в трех из15-ти случаевне наблюдалосьулучшения речи,лишь в шести– интеллектуальнойдеятельности,лишь в двухслучаях непроисходилоулучшенияобщего психическогосостояния. Былоотмечено выраженноестимулирующеевоздействиена функциональнуюактивностьмозга, былоуказано навозможностьпримененияпангаматакальция впсихиатрическойклинике.

Заключение

Довольно!

Чтениепринесло своиплоды: в головеу меня все спуталось

окончательнои я мгновенноубедился, чтоне понимаюничего…

МихаилБулгаков, «Запискиюного врача»

ВитаминыВ₁₂ и В₁₅ играютв организмеважную роль,причем в некоторыхбиохимическихпроцессах онимогут приниматьсовместноеучастие (например,в реакцияхтрансметилирования).Хотя большаячасть данногореферата посвященавитамину В₁₂,я стремилсяпо возможностиподчеркнутьвозможностисовместногоучастия этихвитаминов вбиологическихреакциях.

Все жеглавная задача,поставленнаяпередо мной,заключаласьв возможноболее полномизложениихимическихсвойств цианкобаламинаи пангамовойкислоты ирассмотренииконкретныхпроцессов,проходящихв организмес их участием.

Поэтомупри подборелитературыя руководствовалсястремлениемсконцентрироватьвнимание именнона химическихданных, а не наклиническихисследованияхбиологическойактивностиэтих веществ.В связи с этимнельзя не отметитьтого, что большаячасть литературы,которую можновстретить вбиблиотечныхкаталогах,посвященаименно клиническимаспектам. Впрочем,клиническиеданные такжене были обойденывниманием принаписанииреферата.

Мноюбыли использованыкак источникитруды, принадлежащиеперу исследователей,стоявших уистоков изучениявитаминов В₁₂и В₁₅ (в частностиЛестера Смита)или посвятившихзначительнуючасть своейжизни вопросам,связанным сих участиемв биохимическихпроцессах (какИ. Н. Гаркина).В таких работахя обнаружилне только достаточноеколичествонаучных сведенийпо интересующемуменя вопросу,но и живой интересавторов к обсуждаемойтеме, выливающийсяв увлекательныйи весьма, поэтому,убедительныйстиль изложенияматериала. Этосущественнооблегчилонаписаниеданного реферата.

В связис тем, что рассматриваемыевещества имеютвесьма сложнуюструктуру, аобозначенияих, видимо, ещене устоялисьокончательно,возникалисложности прирассмотренииразных источников,в которых однии те же веществамогли бытьобозначеныпо-разному, атак как в некоторыхстатьях мнене удалосьнайти расшифровкихимическихсокращений,оказалосьнеобходимодополнительношироко использоватьсправочнуюлитературу.

За времяработы надрефератом яполучил достаточнобольшой объемзнаний не толькоо цианкобаламинеи пангамовойкислоте, а этодостаточноспецифическаяинформация,но и по менееконкретнымвопросам, такимкак общиезакономерностивзаимодействияорганизма сбиологическиактивнымивеществами,биохимическиеметоды исследованияи др. Самое большоевпечатлениена меня произвелаколоссальнаясложностьчеловеческогоорганизма каксистемы, в которойсосуществуети взаимодействуетне поддающеесяна первый взглядосмыслениюколичестворазличныхвеществ, а такжето, сколько ещезагадок предстоитразрешитьчеловечествупрежде, чем онопридет хотябы к удовлетворительномупониманиюбиохимическихзакономерностей.

Списокиспользованнойлитературы

1. ЛестерСмит «ВитаминВ₁₂»,Москва, изд.ИностраннойЛитературы,1962 г.

2. А.М. Юркевич, И.П. Рудакова«Структура,свойства имеханизм действиякобаламиновыхкоферментов»,серия «Итогинауки и техники:биоорганическаяхимия», т. 5, Москва,ВИНИТИ, 1985

3. В.М. Березовский«Химия витаминов»,Москва, «Пищеваяпромышленность»,1973 г.

4. Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин«Биологическаяхимия», Москва,«Медицина», 1992 г.

5. А.Л. Ленинджер«Основы биохимии»,Москва, «Мир»,1985

6. «ВитаминВ₁₂и его клиническоеприменение»,Москва, «Медицина»,1956 г.

7. ПаханцеваЕ. С., ПчелкинаВ. В., СыромятниковЕ. Ю. «Кобамидныеферменты и ихроль в реакцияхтрансметилирования»,журн. «Витамины»,вып. 7, Киев, «Науковадумка», 1973 г.

8. И.Н. Гаркина«Пангамоваякислота и еепроизводные»,Москва, ИнститутБиохимии имениА. Н. Баха, 1965 г.

9. И.Н. Гаркина «Вопросымедицинскойхимии», Москва,1962 г.

10. БольшаяСоветскаяЭнциклопедия,Москва, «СоветскаяЭнциклопедия»,1962 г.

Дополнительно:

11. И.В. Стрельчук«О лечениихроническогоалкоголизмаи других наркоманийвитаминомВ₁₅»,Москва, НИИСудебной Психиатрииим. Сербского,1962 г.

12. М.Г. Блюмина, Т.К. Белякова«Опыт применениявитамина В₁₅при олигофренииу детей дошкольноговозраста»,Москва, 1963 г.

*Известнаякачественнаяреакция наα-аминокислоты,дающая интенсивноефиолетовоеокрашивание.

*ТГФК – тетрагидрофолеваякислота.

*Здесь списокзаболеванийпроцитированне полностью

*Т. е. предотвращаетжировую инфильтрациюпечени. Инфильтрация– скоплениев ткани клеточныхэлементов всмеси с кровьюи лимфой.

35