Наряду с неполярными привитыми фазами, выпускаемыми специально для обращенно-фазной хроматографии, в обращенно-фазном варианте часто используют нитрильную и аминную привитые фазы, а иногда и диольную. В этом случае они работают и разделяют вещества в основном по обращенно-фазному механизму, как имеющие короткий (Сз) привитой алкилсилан, а полярные группы или не участвуют в разделении, или играют второстепенную роль, несколько меняя селективность для ряда веществ определенной химической структуры.
В качестве растворителей для обращенно-фазной ВЭЖХ используют преимущественно метанол и ацетонитрил. Другие спирты, кроме метанола, используют редко, так как их вязкость значительно выше и при работе возникает слишком большое давление, а эффективность падает вследствие затрудненной диффузии в подвижной фазе. Тетрагидрофуран также используют значительно реже, во-первых, из-за нестабильности при хранении (он быстро окисляется, накапливая гидропероксиды, которые уменьшают диапазон УФ-пропускания, способны окислять привитую фазу и взрывоопасны), во-вторых, из-за трудности очистки перегонкой (необходимо разрушать пероксиды до перегонки во избежание взрыва).
Ацетонитрил имеет ряд преимуществ перед метанолом. При хорошей очистке он лучше пропускает в ближнем ультрафиолетовом диапазоне (ниже 210 нм) и позволяет работать в смеси вода — ацетонитрил при 200 и даже 190 нм. Он обычно обладает лучшими растворяющими свойствами для проб, чем метанол. При использовании смесей метанол — вода вязкость такой смеси не является аддитивной величиной (так же как и для смесей ацетонитрил — вода) и при 25 °С меняется от 0,89 и 0,57 МПа⋅с (для чистых воды и метанола соответственно) до 1,4 (цифры для смеси ацетонитрил — вода соответственно 0,89, 0,43 и 0,98). Большая вязкость смесей метанол — вода по сравнению со смесями ацетонитрил — вода (почти в 1,5 раза) затрудняет использование колонок, заполненных частицами сорбента размером 3 и 5 мкм, при использовании водно-метанольных смесей. Точно так же при градиентном элюировании колонки, работающие с системой метанол — вода, подвергаются при равном расходе действию больших давлений и быстрее выходят из строя. Наконец, не малую роль играет и то обстоятельство, что метанол относится к группе особо опасных ядов, находящихся на строгом контроле и учете, тогда как ацетонитрил к этой группе не относится.
К недостаткам ацетонитрила, несколько ограничивающим его использование, относятся его довольно высокая стоимость (особенно высокочистых сортов, предназначенных для ВЭЖХ и УФ-спектроскопии), некоторая токсичность, требующая предосторожностей при работе, а также то, что его труднее, чем метанол, освобождать от воды, так как он образует азеотропную смесь с водой. Это затрудняет его регенерацию из отработанного растворителя, что особенно важно при большом масштабе работы, например, при препаративной работе.
Особо следует сказать о качестве воды и о требованиях к ней. Вода, являющаяся в настоящее время одним из важнейших растворителей для ВЭЖХ, является как самым доступным, так и очень трудным для тщательной очистки растворителем. Если для изократических разделений, особенно при использовании не очень чувствительных шкал и работе не в ближнем УФ-диапазоне удается обойтись бидистиллятом (не деионизи-рованной водой!), то для градиентной работы и работы с высокочувствительными детекторами такого качества воды уже недостаточно. Деионизированная вода, как правило, не подходит для использования в ВЭЖХ: органические иониты, используемые для извлечения из нее неорганических ионов, дают воду с очень низкой проводимостью, однако очень заметно обогащенную органическими загрязнениями по сравнению с водой до деионизации. Удалить все органические соединения из воды очень трудно, особенно микроколичества — никакая перегонка или ректификация не помогают, так как вследствие образования азеотропных смесей отделить примеси органических соединений не удается.
Существуют системы высокой очистки воды, осуществляющие деионизацию с последующим извлечением органических соединений адсорбентами, однако они достаточно дороги. Разработаны системы, позволяющие резко уменьшить содержание органических соединений в воде путем обработки ее мощным УФ-облучением, иногда с последующей обработкой адсорбентами. Эти системы дешевле, но не так универсальны. Наконец, существуют патроны, заполненные адсорбентом, рассчитанным на извлечение органических соединений из определенного объема воды (обычно из 15 л) — они достаточно недороги и удобны, позволяют получить ровно столько очищенной воды, сколько нужно для ближайшей работы. Высокочистая вода нестабильна при хранении, поэтому лучше ее использовать достаточно быстро и свежеприготовленную.
Как же поступить в том случае, если таких систем или патронов в распоряжении исследователя нет? Тогда следует взять наиболее чистую воду, имеющуюся в лаборатории, и пропустить ее через колонку, заполненную чистым обращеннофазным сорбентом с привитой фазой C18. Все органические примеси из воды будут сорбироваться в начале колонки, а чистая вода без примесей — накапливаться в сосуде. После пропускания определенного объема воды, зависящего от количества органических загрязнений в ней, колонку промывают чистым метанолом или ацетонитрилом, смывая загрязнения, после чего она снова готова к работе.
Возможны разные варианты такой очистки. Можно просто при использовании градиента высокого давления установить колонку с привито-фазным сорбентом C18, желательно не обладающую большим гидравлическим сопротивлением (с зернением 20 или 15 мкм), после насоса, подающего чистую воду, до смесителя. В этом случае колонка будет очищать ровно столько воды, сколько нужно для работы, и вода будет самая свежеочищенная. Можно использовать стеклянную колонку, заполнив ее более крупным препаративным сорбентом (например, 40 — 63 мкм), и подавать воду под гидростатическим давлением, получая столько воды, сколько нужно на день работы. Можно, наконец, использовать полупрепаративную или препаративную колонку для ВЭЖХ и качать воду насосом хроматографа, используя для очистки воды ночное время, когда аналитическая работа не нужна. Какой вариант удобнее, решает сам исследователь. Работая в градиентном режиме с водно-метанольными и водно-ацетонитрильными растворами, всегда следует ежедневно дегазировать растворители наилучшим из возможных способов, особенно если используют градиент на стороне низкого давления. Никогда не будет лишним иметь на выходе из детектора клапан или гидравлическое сопротивление, поддерживающее в кювете детектора избыточное давление около 0,05 — 0,3 МПа. .Это простое приспособление позволяет добиться того, что пузырьки воздуха, если они и образуются, образуются уже после такого клапана, за кюветой детектора, и не мешают работе.
Распределительная хроматография с нанесенными фазами
Этот вариант распределительной жидкостно-жидкостной хроматографии был одним из первых, примененных для ВЭЖХ. Однако в отличие от ГЖХ, где нанесение на носитель жидкой неподвижной фазы является наиболее популярным методом работы, обеспечивающим большую часть аналитических разделений, он не нашел в ВЭЖХ широкого применения и был вытеснен привито-фазными сорбентами. Тем не менее, работы с его использованием проводят, и в некоторых случаях применение распределительной хроматографии с нанесенными фазами вполне оправдано.
Неподвижную фазу и растворитель обычно подбирают таким образом, чтобы они были практически взаимно нерастворимы. Это понятно, так как в противном случае нанесенная фаза будет быстро вымываться из колонки растворителем. Такими комбинациями фазы и растворителя являются, например, трис (цианэтокси) пропан и гексан, парафиновое масло и вода. Однако при работе с такими системами компоненты образца, как правило, обладают коэффициентами распределения близкими или к нулю, или к бесконечности, т.е. или элюируются с фронтом растворителя без разделения, или задерживаются в колонке бесконечно долго. Методы нанесения неподвижной фазы могут быть разными. Фаза может быть растворена в подходящем растворителе с низкой температурой кипения и нанесена методом испарения, как это делают в ГЖХ. Фаза может быть нанесена непосредственно в виде жидкости или пара. В обоих случаях заполнение колонок представляет трудности, если частицы сорбента меньше 40 мкм и не могут быть использованы для заполнения «сухим» способом.
Более популярным является динамический метод нанесения неподвижной фазы. Он заключается в том, что носитель, например силикагель с размером частиц от 5 до 10 мкм, вносят в колонку обычным суспензионным способом. На колонку подают заданный объем раствора неподвижной фазы, потом прокачивают растворитель, насыщенный неподвижной фазой, до установления равновесия. Носитель в колонке равномерно покрывается неподвижной фазой, она находится в равновесии с насыщенным фазой растворителем. Такая система будет стабильной и не нуждается в восстановлении из-за уноса фазы. Насыщение растворителя фазой может проводиться в предколонке с той же фазой, устанавливаемой после насоса до инжeктоpa и периодически заменяемой. Недостатки распределительной хроматографии с нанесенными фазами следующие. Невозможно использовать градиентную ВЭЖХ из-за уноса фазы. Невозможно работать в препаративном режиме, так как собранные фракции, естественно, будут содержать заметное количество нанесенной фазы, остающейся в образце после упаривания растворителя. Трудно менять состав растворителя, так как при этом колонка длительно приходит в новое равновесное состояние с новым растворителем. Затруднено использование повышенных температур для анализа, так как растворимость неподвижной фазы при повышении температуры заметно возрастает. Растворитель, в который вводится проба, должен по составу быть максимально близким к подвижной фазе, иначе возможны частичный смыв веподвижной фазы, ложные пики и нарушение процесса хроматографии. Несколько слов о носителе и его желательных характеристиках для распределительной хроматографии с нанесенными фазами. Он должен иметь достаточно большой объем пор, быть при этом прочным механически (допускать суспензионное заполнение колонки), иметь крупные поры и не очень большую поверхность. Наносимая фаза не должна быть высоковязкой, чтобы не было затрудненного массообмена и снижения эффективности разделения по этой причине.
Литература:
1.Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях: Пер. с англ. М., Мир, 1980. 245 с.
2.Жидкостная колоночная хроматография/Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янака. Пер. с англ, (в 3-х томах). М., Мир, 1978.
3.Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985. 536 с. 9 Berendsen G. E., DeGalan R./l. Chromatogr., 1980, v. 196, No. 1, p. 21—37.
4. Cooke N. H. C., Olsen /(./J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 1—12.
5. Scottt C. D., Lee N. E./J. Chromatogr., 1973, v. 83, p. 383—393.
6. Kabra P. M., Marion L. J. Liquid Chromatography in Clinical Analysis. Humana Press, Cliftond, 1981. 466 p.
7. Edelson E. H., e. a./J. Chromatogr., 1979, v. 174, p. 409—419.