Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів (стр. 5 из 9)

Пероксиди ліпідів є достатньо нестійкими речовинами, які легко підлягають гомолітичному розпаду. Тому результати кількісного аналізу гідропероксидів відображають лише стаціонарні концентрації цих продуктів в ліпідних системах [27]. Більш стійкими є вторинні продукти ПОЛ. Особливий інтерес при цьому представляють спектральні методи (УФ-спектрофотометрія), які широко використовують при вивченні нестійких проміжних продуктів. Застосування спектрофотометричного методу обмежено тим, що в короткохвильовій області спектру суттєво поглинання ізольованих подвійних зв’язків, тобто його можна розглядати як приблизний напівкількісний.

Подальше перетворення утворених продуктів призводить до утворення малонового діальдегіду [2,27], які визначають за кольоровою реакцією з тіобарбітуровою кислотою. ТБК-тест дуже зручний для дослідженя швидкості ПОЛ в ізольованих системах. В роботі [36] проводили оцінку АОА плазми крові та фармакологічних препаратів за накопиченням ТБК-активних продуктів з використанням як модельної системи дисперсії жовточних ліпопротеїнів. В цей час найбільш чутливим методом виявлення вільнорадикальних інтермедіатів є метод, що оснований на вимірюванні інтенсивності хемілюмінесценції електронно-збуджених продуктів, які утворюються за реакцією рекомбінації ліпідних радикалів. Проте хемілюмінесцентний (ХЛ) метод дозволяє виявляти не самі радикали, а ті молекулярні продукти їх рекомбінації, що виявляються у збудженому стані, тобто ХЛ є непрямим методом регістрації ліпідних радикалів.

ХЛ свідчить про швидкість рекомбінації алкілпероксидних радикалів у зразку. Ця особливість метода може бути використана для дослідження процесів ПОЛ, які швидко розвиваються. Другою важливою перевагою цього метода є його висока чутливість (10^-10М) [27].

Недолік ХЛ метода полягає у неможливості контролювати фізико-хімічні властивості ліпідів, що призводить до зниження відтворюваності результатів ХЛ досліджень.

В якості модельної системи часто використовують дисперсію жовточних ліпопротеїнів (ЖЛП). Її готують різними способами: екстракцією хлороформно-метанольною сумішшю [2]; шляхом суспензування ЯЖ в фосфатному буфері [37] або в дистильованій воді [37]. В роботах при окисненні ЖЛП використовують буфери – трис-HCl [2], фосфатний в присутності солей NaCl [38] чи KCl [39], які забеспечують фізіологічне рН = 7,4. Концентрація заліза змінюється в інтервалі 10^-4 - 2•10^-2 М.

Для дослідження кінетики окиснення вуглеводнів крім ХЛ широко використовують газоволюмометричний метод. Відомості про використання газометричного метода в літературі є лише для таких модельних систем як метилолеат [40], олеїнова кислота, етилбензол, але не дисперсія ЖЛП. Оскільки ліпосоми ЯЖ є найближчим аналогом біомембран, дослідження можливості їх використання в якості субстрата окиснення на газоволюмометричній установці є актуальним.

2. Експериментальна частина

2.1.1 Газоволюмометричний метод

Одним із простих і розповсюджених методів вивчення кінетики рідиннофазних реакцій окиснення органічних речовин є метод вимірювання кількості поглиненого кисню. Газоволюмометричний метод дозволяє вимірювати швидкість окиснення з великим ступенем точності при малих глибинах перетворення, коли впливом продуктів окиснення на кінетику реакції можна знехтувати.

Існують різні варіанти газоволюмометричних установок, загальний принцип їхньої дії полягає у вимірюванні швидкості поглинання кисню при постійному тиску. Визначення кінетичних параметрів процесу інгібованого окиснення: період індукції, константу швидкості реакції з пероксильними радикалами, коефіцієнт інгібування і ряд інших кінетичних характеристик проводили на установці для автоматичної реєстрації і запису поглинання кисню "Кулон-1" з фотоелектронним датчиком заводу інституту хімічної фізики РАН (рис.2.1).

Установка складається з реакційної судини (1), зануреної в термостатовану ячейку (2), термостатованої газової бюретки (3), електролітичної ячейки з платиновими електродами (електроліт - насичений розчин щавлевої кислоти) (4), регулятора тиску (5), заповненого ундеканом, і манометра (6), фотоелектроннного датчика (8), підсилювача датчика (9), стабілізатора струму (10). Перед початком досліду бюретка, регулятор тиску і реакційна судина з речовиною, що окиснюється, заповнюються до атмосферного тиску киснем. Для проведення окиснення реакційна судина нагрівається до певної температури за допомогою термостата, при безперервному перемішуванні, після двоххвилинного прогріву з'єднується збюреткою і регулятором тиску. Фотоелектронний датчик через стабілізатор струму з'єднаний з електролітичною ячейкою. Під час реакції кисень з бюретки надходить у реакційну судину, при цьому тиск у системі падає, і в зв'язку з цим включається електролітична ячейка. Газ, що виділився з ячейки, підвищує тиск у термостатованому об'ємі і піднімає рівень ундекану в бюретці, у результаті чого тиск у системі вирівнюється. Швидкість просування меніска ундекана в бюретці пропорційна швидкості реакції.

Рисунок 2.1 -Схема газоволюмометричної установки: 1 - реакційна судина, 2- термостат, 3 - газова бюретка, 4 - електролітична ячейка, 5 - регулятор тиску, 6 - манометр, 7 - термостатований об'єм, 8 - фотоелектронний датчик, 9 - підсилювач датчика, 10 - стабілізатор струму.

Сила струму на електролізері складала 0.2 А. Установка дозволяє вимірювати швидкість поглинання кисню - від 10^-7-10^-8 моль-л^-1∙с^-1 і більше. Об'єм реакційної суміші дорівнює 5 мл, частота перемішування - 8-100 с^-1. Вимірювання проводили в кінетичній області при тиску кисню 1 атм. і температурі 310К.

2.2. Тонкошарова хроматографія (ТШХ)

Метод ТШХ полягає в наступному [41]: на один бік невеликої скляної пластинки наносять тонкий шар сорбента. На такий шар на стартову лінію наносять проби речовин та їх сумішей, і кінець пластинки, нище стартової лінії, занурюють в систему розчинників. За мірою просування рідини по пластинці відбувається розподіл суміші речовин. Границю підйому рідини чи лінію фронту позначають, пластинку висушують і проявляють для визначення речовин у вигляді забарвлених плям. Відмічають положення плям, які відповідають досліджуваним речовинам, що знаходяться між лінією старта і лінією фронту рідини. Для цього вимірюють відстань від центра плями до стартової лінії (АБ). Потім визначають відстань від лінії фронту рідини до стартової точки (АВ). Співвідношення відстані від стартової лінії до центра плями (АБ) та відстані від стартової лінії до лінії фронту (АВ) позначається через константу R_f, яка характеризує положення речовини на хроматограмі. Таким чином, величина R_f = АБ/АВ характерна для даної сполуки на даному сорбенті і в даній системі.

В якості носія для нерухомої фази використовують силікагель, а в якості системи розчинників – хлороформ-бензол-гексан в співвідношенні 30:6:1. По закінченню пластинку з отриманими результатами проявляють парами аміаку.

2.3. Техніка безпеки

2.3.1. Правила безпечної роботи в хімічних лабораторіях

Загальна організація роботи по техніці безпеки покладена на керівників відділів. Працювати в хімічних лабораторіях дозволяється особам віком не менше 18 років, які пройшли інструктаж з ТБ.

У всіх приміщеннях лабораторії повинна бути встановлена витяжна вентиляція. Всі роботи, пов'язані з виділенням шкідливих парів або газів, повинні проводитись у витяжних шафах. Зберігання різних хімічних речовин у лабораторіях повинно відбуватись із врахуванням їх властивостей. Залишати робоче місце і нагрівальні прибори без нагляду заборонено.

В кожній лабораторній кімнаті на певному місці повинні знаходитись вогнегасник, пісок, ковдра. Всі реактиви в лабораторіях повинні зберігатись в тарі з підписом. В лабораторії повинно знаходитись не менше двох чоловік. Всі роботи в лабораторії повинні проводитись при задовільному стані електрообладнання.

2.3.2 Основні правила безпеки при роботі з їдкими речовинами

Роботу з концентрованими кислотами та лугами без захисного обладнання заборонено. Концентрована кислота повинна зберігатись у товстостінному скляному посуді ємністю не більше 1 л у витяжній шафі. Розлиті кислоти або луги необхідно миттєво засипати піском. Після уборки піска це місце нейтралізують: кислоту - лугом або содою, луг - слабким розчином оцтової кислоти. Не можна набирати концентровані кислоти та луги в пипетки ртом. При використанні хромової суміші необхідно запобігати попаданню суміші на шкіру, одяг та взуття. Заборонено зливати концентровані кислоти та луги в каналізацію, їх слід окремо збирати в посуд і після нейтралізації зливати в зливи для неорганічних речовин.

2.3.3. Основні правила безпечної роботи з електрообладнанням та електроприладами

Заборонено переносити включені прилади та ремонтувати обладнання, що знаходиться під струмом. Заборонено працювати поруч з оголеними частинами обладнання. Заборонено загромаджувати підступи до електричних приладів. У випадку припинення подачі струму всі приклади повинні бути миттєво відключені. Заборонено залишати без нагляду включені прилади. У випадку загорання проводки слід негайно вимкнути електрику та погасити вогонь за допомогою вуглекислотного вогнегасника та ковдри з асбесту.