Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів (стр. 6 из 9)
3. Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів
Для оцінки антиоксидантної активності сполук застосовується велика кількість методів і тестових систем [27,33]. При підборі інгібіторів для збереження продуктів харчування, що містять фосфоліпіди (рослинні олії, жири, риба, м'ясо і т.д.), а також при рішенні медичних проблем, зв'язаних з окисненням ліпідів мембран, кращою моделлю є лецитинова ліпосомна емульсія [33]і в біології в якості тестової широко використовується емульсія яєчного жовтка (ЯЖ) [36,39] – гетерогенна система, що містить мембранні структури кліток (при розведенні у фосфатному буфері фосфоліпіди ЯЖ утворюють міцели подвійного шару - ліпосоми), і яка відповідає за ліпідно-білковим складом ліпопротеїнам низкої густини плазми крові [36]. У порівнянні з гомогенатами тканин вона доступна, стабільна при збереженні і, разом з тим, відрізняється високою окиснюваністю, що дозволяє використовувати звичайні лабораторні методики й апаратуру для визначення рівня ПОЛ. Застосування складного природнього субстрату (ЯЖ) утруднює одержання надійних кінетичних даних, але дає можливість якісно оцінити АОА різних сполук.
Загальноприйнятими методами дослідження ПОЛ у даний час є [42] хемілюмінесцентний (ХЛ) і за виміром продуктів пероксидації, таких як дієнові коньюгати, малоновий діальдегид (МДА), гексаналь, пероксиди. На жаль, усі методи не досконалі, тому що мають ряд недоліків. У той же час газоволюмометричний метод вивчення радикально-ланцюгових процесів окиснення (ГВ), який широко використовується на практиці для інших систем, практично не застосовується при дослідженні ПОЛ, очевидно, через низьку чутливість стандартних газоволюмометричних установок. Заміна ртутного нуль-датчика тиску фотоелектронним або чуттєвим елементом тиску дозволили вивчати окисні процеси, що протікають зі швидкістю 10-6 – 10-8 моль • м-1 • с-1.
Окиснення проводилося в умовах близьких до фізіологічних: ~3,3% дисперсія вимороженого яєчного жовтка у фосфатному буфері (рН=7,4, 0,04М КН2РО4/К2НРО4, 0,14М NaCl) t=37ºC, [Fe2+]=5·10–3моль/л.
 |
Вплив інкубації на окиснення ЖЛП можна простежити за кінетичними кривими поглинання кисню (рис.3.1).
 |
 |
Рис.3.2 – Температурна залежність швидкості окиснення 9 % дисперсіі ЖЛП при [Fe2+] = 2,5•10-3M.
При варіюванні температури було встановлено, що вище 400С швидкість окиснення помітно знижується, а при 500С поглинання кисню відсутнє. Це узгоджується з уявленнями [2] про ферментативний шлях залізоініційованого окиснення біологічних систем. Ферменти, що містяться в них, (НАДФН), що відновлюють ініціатор, інактивуються при підвищених температурах, що і призводить до зниження швидкості окиснення. Оптимальна температура, при якій спостерігається максимальна швидкість окиснення - 370С.
Концентрація субстрату окиснення (рис.3.3) складно впливає на швидкість процесу.  |
Рис.3.3 – Кінетичні криві поглинання кисню в процесі залізоініційованого окиснення ЯЖ в залежності від масової частки субстрата окиснення; [Fe2+] = 2,5•10-3M, [ЯЖ], % мас.: 1 – 3,2; 2 – 4,8; 3 – 16,7; 4 – 25,0.
При вмісті в розчині ЯЖ до 1% по масі поглинання кисню не спостерігається, далі швидкість зростає і досягає максимуму при 3,2%. Подальше підвищення концентрації ЖЛП призводить до зниження окиснюваності дисперсії. Це може бути наслідком як збільшення вмісту в системі ендогенних АО, так і підвищення ролі структурного інгібувания і дифузійних процесів при окисненні. Оптимально робоче співвідношення в системі ЯЖ і буфера 1:30. Дослідження впливу парціального тиску кисню в системі на швидкість окиснення при оптимальному вмісті субстрату показала, що зміна тиску в інтервалі 700 мм рт. ст. – 1 атм., як і зміна інтенсивності перемішування, не впливають на швидкість процесу, що свідчить про протікання його в кінетичній області.
Вплив концентрації ініціатора на окиснення дисперсії представлено на рис.3.4. Двовалентне залізо, як відомо [2], виступає ініціатором процесу, але у великих концентраціях може й інгібувати ПОЛ. Отримані результати (рис.3.4) підтверджують це, а максимальна швидкість окиснення досягається при [Fe2+]=5• 10-3моль/л.
 |
Рис.3.4 – Залежність об¢єму поглиненого кисню при окисненні ЯЖ (3,2 % за масою) при 370С від концентрації ініціатора, t = 15 хв.
Окиснення емульсії яєчного жовтка в оптимальних умовах дозволило одержати в паралельних дослідах відтворені результати за значеннями швидкостей процесу і періодів індукції. Готування розчину й окиснення проводили наступним чином: попередньо виморожений протягом доби яєчний жовток (зберігається при –80С) розводили буфером у співвідношенні 1:30. Після добової інкубації дисперсії проводили окиснення. У нульовому досвіді в реактор поміщали 4,9 мл дисперсії ЯЖ, додавали 0,1 мл 0,025 М водного розчину FeSO4• 7H2O; при дослідженні АОА препаратів уводили 0,1 мл розчину інгібітору необхідної концентрації. Концентрація ініціатора в реакційній суміші була постійною 5• 10-3М.
Окиснення фосфоліпідів у даній системі протікає, як доведено в роботі [2], за вільнорадикальним механізмом. Процес має свої особливості, зв'язані насамперед з тим, що окиснення проходить на границі розділу фаз, процес гетерогенний, ініціатор – метал перемінної валентності, дисперсійне середовище – вода. Ефективність інгібітору повинна залежати від його колоїдної локалізації, розподілу між водною і масляною фазами, взаємодії з поверхнево-активними речовинами емульсії й ініціатором [32]. Незважаючи на велику кількість досліджень, присвячених вивченню антиоксидантних властивостей різних речовин у ліпідних субстратах, дотепер не отримано однозначних даних навіть про поведінку в таких системах іонола. В зв'язку з цим було проведене дослідження антиоксидантної активності типових фенольних антиоксидантів у процесі залізоініційованого окиснення емульсії яєчного жовтка. Необхідно відзначити, що ортополіфеноли, що є найбільш ефективними антиоксидантами неможливо досліджувати на даній модельній системі, тому що вони утворюють комплекси з ініціатором окиснення – двовалентним залізом, тим самим, виводячись із системи. Контроль за процесом окиснення емульсії здійснювали за поглинанням кисню. Вплив на окиснення різних фенольних антиоксидантів оцінювався при однакових концентраціях (10–3моль/л). Отримані кінетичні результати приведені на рис.3.5. Видно, що вивчені сполуки в межах помилки вимірів (±5 хв) практично не впливають на величину періоду індукції окиснення модельної емульсії, обумовленого наявністю ендогенних антиоксидантів.
Вплив уведених добавок позначається на швидкості процесу окиснення після виходу з періоду індукції, що пропорційна об’єму поглиненого кисню. Як критерій антиоксидантної дії фенолів обрана величина (V0–V)/V0, де V0– об’єм поглиненого кисню емульсією без добавок фенолу через 20 хв після початку окиснення, V - об’ємкисню, поглиненого емульсією, що окиснюється, з добавками фенолу в той же момент часу.
Очевидно, що чим більше відношення (V0–V)/V0, тим ефективніше антиоксидант в обраних умовах гальмує процес окиснення.
 |
З рис.3.5 видно, що феноли в різному ступені гальмують окиснення фосфоліпідів яєчного жовтка, що обумовлено будовою антиоксиданту.
Рис.3.5 – Кінетичні криві поглинання кисню при залізоініційованому окисненні ЯЖ в присутності [InH] = 1•10-3M:
1. [InH] = 0
2. ферулової кислоти
3. емоксипіна
4. 7-гідрокси – 4-метилкумарина
5. фенікаберана
6. арбідола
7. іонола
Зі збільшенням концентрації уведеного фенолу ступінь гальмування окисного процесу в емульсії яєчного жовтка зростає. Причому вплив концентрації фенолів різний для слабких і сильних антиоксидантів. Так для емоксипіна, що є слабким антиоксидантом (рис.3.6), зниження швидкості окиснення фосфоліпідів спостерігається тільки при досить високих концентраціях (10-3– 10-4 моль/л) і плавно змінюється з ростом концентрації. У той же час іонол (рис.3.7) гальмує процес вже при концентрації в системі 10-5–10-6 моль/л, а подальше збільшення концентрації суттєво не змінює швидкості процесу. Таке розходження в поведінці різних фенольних антиоксидантів виявляється в концентраційній залежності параметра, що характеризує ефективність фенолу у вивченій системі. Для слабких антиоксидантів (рис. 3.8) залежність (V0–V)/V0 від концентрації фенолів лінійна, а для сильних (рис.3.9) має верхню границю.