Хотя оксид алюминия широко и давно используют в колонной и тонкослойной хроматографии, его применение в ВЭЖХ имеет ограниченный характер. Это связано с тем, что микрочастицы оксида алюминия выпускают не все фирмы-производители сорбентов, а привитые фазы на этой основе не выпускаются совсем. Тем не менее в некоторых случаях, когда требуется селективность, отличная от селективности силикагеля, оксид алюминия применяют. Его также используют и в тех случаях, когда нужно перейти к ВЭЖХ от методики ТСХ, размотанной на пластинках с оксидом алюминия.
Привитые сорбенты на основе силикагеля для нормально-фазной и обращенно-фазной хроматографии
Сорбенты с химически привитыми фазами на основе силикагеля появились позже сорбентов, на которые неподвижная фаза (в виде индивидуальных веществ или, чаще, полимеров различной структуры и полярности) наносилась физически, т.е. аналогично тому, как фазу наносили и продолжают наносить в газожидкостной хроматографии. Нанесенная фаза довольно быстро смывается растворителем (гораздо быстрее, чем она испаряется или изменяется в газожидкостной хроматографии), параметры удерживания постоянно меняются, препаративно собираемые фракции загрязняются фазой. Использование растворителя, насыщенного неподвижной фазой, позволило несколько повысить стабильность таких сорбентов и колонок, однако большинство недостатков при этом осталось.
Эти проблемы можно решить, если химически привить органическую неподвижную фазу к силикагелевой матрице. Силанольные группы, находящиеся в большом количестве на поверхности силикагеля (особенно полностью гидроксилированного), обладают слабокислыми свойствами и довольно легко вступают в многочисленные реакции. Первые из полученных таким путем привитофазных сорбентов, названных «щеточные» (привитые молекулы, как щетина в щетке, покрывали поверхность силикагеля), изготовляли этерификацией силанолов спиртами с образованием простой эфирной связи. Однако обратимость реакции, особенно в кислой и щелочной средах и в присутствии водных подвижных фаз, в большой мере ограничивала как срок работы таких сорбентов, так и области их применения.
Позднее были разработаны методы получения привитых фаз разного типа с использованием гораздо более прочных и устойчивых к гидролизу связей Si-О–Si и Sj-С. Практически все имеющиеся в продаже привитофазные сорбенты относятся к этому типу, их более 200. Привить химически фазу к силикагелю может любой высококвалифицированный химик-органик по имеющимся прописям. Однако приготовить сорбент, воспроизводимый от партии к партии, чрезвычайно трудно, это не всегда удается даже обладающим как патентами, так и «ноу-хау» лабораториям и производствам фирм-изготовителей. Еще более проблематичной является попытка воспроизвести в лаборатории какой-то фирменный сорбент по имеющимся литературным и патентным данным; множество нюансов в подготовке исходного силикагеля, растворителей и реагентов, проведении реакции, удалении непрореагировавших реагентов и побочных продуктов сводят шансы на удачу почти к нулю. Точно так же проблематичным является использование при воспроизведении описанных в литературе разделений «аналогов» сорбентов других форм, что в первую очередь относится к сложным разделениям и использованию обращенно-фазных сорбентов. Сказать «использовался обращенно-фазный сорбент, представляющий собой октадецилсилан, привитый к силикагелю», – значит не сказать почти ничего, если не указана фирма-производитель. Многочисленные описанные в литературе случаи инверсии порядка выхода пиков смесей на разных сорбентах «С18 на силикагеле» и других или даже полной адсорбции ряда веществ на другом сорбенте подтверждают этот факт.
Тем не менее привито-фазные сорбенты сейчас наиболее популярны, несмотря на их высокую стоимость и отмеченные недостатки. Более 60% разделений методом ВЭЖХ (по другим данным-более 70%) выполняют с использованием только обращенно-фазных привитых сорбентов, основным из которых является сорбент с привитой фазой C18.
Можно отметить следующие преимущества, обеспечивающие преобладающее использование привитых сорбентов на основе силикагеля: механическая устойчивость к высоким давлениям; отсутствие перехода привитой фазы в растворитель в процессе хроматографического разделения (если не протекают реакции, приводящие к химическому отщеплению привитой фазы); устойчивость к действию растворителей, температуры, воды, рН; быстрота установления равновесия при смене элюента, что обеспечивает оперативность работы и возможность работы в градиентном режиме с быстрым возвратом к исходному режиму; возможность варьировать в широких пределах селективность за счет изменения степени прививки, дополнительной химической обработки и замены растворителя.
Так как среди начинающих работать в области ВЭЖХ очень большой процент составляют специалисты по ГХ, имеет смысл сделать следующее замечание. Очень большой ассортимент неподвижных фаз (неоправданно большой, по мнению многих компетентных ученых) в ГХ и стремление иметь как можно более широкий выбор фаз и в ВЭЖХ–основная ошибка начинающих. Если в газовой хроматографии, по крайней мере в ее классическом варианте, подвижная фаза практически не оказывает влияния на селективность разделения, то в жидкостной хроматографии ее влияние огромно. Так как в разделении очень активно участвуют как привитая фаза, так и адсорбированные (абсорбированные) компоненты подвижной фазы, широкий ассортимент сорбентов для ВЭЖХ в большинстве случаев не нужен. Изменением состава подвижной фазы очень часто легко добиться той же селективности, что и за счет применения нового дорогостоящего привито-фазного сорбента. Приведенное выше утверждение не относится, конечно, к принципиально новым вариантам сорбентов для ВЭЖХ (например, особо широкопористым, предназначенным для работы с большими молекулами, такими, как белки). Для начинающего же работать в ВЭЖХ рекомендуется тщательно изучить 2–4 сорбента, находящие применение для его объектов исследования, и широкий ассортимент растворителей и добавок разного типа, их влияние на разделение данного класса веществ на выбранной группе сорбентов. Только после того, как приобретен опыт работы с привитыми фазами в комплексе с растворителями, но есть задачи, которые не удается решить с их помощью, следует пробовать новые привитые фазы. Справедливость данного замечания как раз и подтверждается тем, что 60–70% успешных разделений, описанных в литературе, проведено только на привитых фазах одного типа – обращенно-фазных, к рассмотрению которых мы сейчас и перейдем.
Наиболее популярными являются так называемые обращенные привитые фазы, применяемые в обращенно-фазной ВЭЖХ. Понятие «обращенный» пришло от классической ЖХ на силикагеле, где в «прямой» системе подвижная фаза неполярна. а неподвижная полярна (соответственно гексан и силикагель). По этому принципу «обращенная» система должна иметь полярную подвижную фазу и неполярную неподвижную (соответственно водный метанол и октадецилсилан на силикагеле, привитый химически). Названия обращенно-фазный сорбент и обращенно-фазная система не являются особенно удачными или понятными, однако так как это название общепринято, то мы будем его придерживаться.
Поверхность силикагеля, как известно, – довольно большая и развитая (обычно 100–600 м2/г), и в случае гидроксилированного силикагеля покрыта в основном силанольными группами, имеющими концентрацию около 5 на 1 нм2 поверхности. Расчетная максимальная плотность силанольных групп на поверхности несколько выше и составляет около 8 на 1 нм2. Полное гидроксилирование поверхности силикагеля достигается путем его обработки водой при кипении в течение нескольких часов.
Для получения обращенно-фазного сорбента гидроксилированный силикагель обычно обрабатывают хлорсиланами, которые вступают в реакцию довольно активно и образуют при этом устойчивые к гидролизу связи – Si-О–Si-С– Несмотдя на кажущуюся простоту процесса, оказалось, что имеются многочисленные сложности. Первоначально считали, что все силанольные группы вступят в реакцию с образованием мономолекулярного слоя привитой фазы. На практике оказалось, что не все силанольные группы, а только 1,5–2,2 на 1 нм2 вступят в реакцию с алкилхлорсиланами, а остальные не могут реагировать вследствие стерических препятствий и остаются на поверхности сорбента. Правда, привитые группы стерически затрудняют подход к ним молекул анализируемых веществ в процессе разделения.
Первоначально использовали для прививки промышленно доступные три- и дихлорсиланы (октадецилтрихлорсилан и др.), которые, будучи ди- и трифунк-циональными, способны вступать друг с другом в реакцию полимеризации до того, как вступят в реакцию с силанольными группами. Эта полимеризация приводит к тому, что на поверхности могут образоваться значительно более толстые, чем мономолекулярные, полимерные слои фазы (более или менее сильно привитые к поверхности силикагелевой матрицы). В этом случае содержание привитого углерода, определяемое сжиганием, окажется выше, чем теоретически должно привиться по схеме монослойного покрытия поверхности силикагеля. При этом, несмотря на сильное удерживание пробы из-за высокого содержания привитой фазы, эффективность разделения за счет затрудненной диффузии в толстых полимерных пленках может заметно упасть. В то же время большие участки поверхности силикагеля окажутся не покрытыми фазой, что приведет к сильному взаимодействию анализируемых веществ с неэкранированными силанольными группами.