Для получения распределительных систем с полярными твердыми фазами (например, силикагель) рекомендуются тройные смеси растворителей, состоящие из неполярного элюента (например, гептана, дихлорметана), сильнополярного компонента (обычно воды) и низкомолекулярного спирта или другого растворителя, смешивающегося и с водой, и с неполярным компонентом. При подборе системы растворителей жидкую фазу можно удалить промыванием колонки, например, дихлорметаном. После этого колонка пригодна для нанесения новой неподвижной фазы.
Для достижения оптимального разделения необходимо, чтобы разделяемые вещества лучше растворялись в неподвижной фазе. Вещества с коэффициентом распределения, близким к единице, при распределительной вымываются с фронтом подвижной фазы. Гидрофильные вещества лучше разделяются при использовании гидрофильных сорбентов (силикагель, крахмал, целлюлоза), а для разделения гидрофобных веществ можно воспользоваться сорбентами для ОФ хроматографии.
Макромолекулы БАС отличаются внутри своих индивидуальных групп по физико-химическим свойствам незначительно. Одним из наиболее характерных свойств БАС является способность обратимо связывать другие вещества, называемые в общем случае лигандами или аффинными лигандами (аффинатами). Например, фермент – ингибитор, антиген – антитело. Именно эта способность служит основой для аффинной хроматографии.
Выбор аффинных лигандов осуществляется на основании их биологической природы и биологических свойств разделяемых соединений. Состав элюента подбирается таким образом, чтобы образующийся комплекс, например фермент – ингибитор, на первом этапе элюирования не разрушался, а балластные вещества легко элюировались. Затем, состав элюента меняют таким образом, чтобы разрушить образовавшийся комплекс. Состав элюетна, рН ионная сила также зависят от биологической природы выделяемого соединения.
Требования к носителям.
Стерическая доступность.
Образование комплекса БАС с лигандом, который ковалентно связан с матрицей требует достаточного пространства. Поэтому одно из выжнейших свойств носителей – высокая пористость. Однако, пористость не играет роли при хроматографии полисом, рибосом, интактных клеток. В этом случае все взаимодействия происходят с поверхностными группами сорбента.
Конформация присоединенного лиганда.
Высокая реакционная способность специфических субстратов обусловлена наиболее благоприятной конфигурацией групп субстрата. Поэтому способы привязки лиганда ограничены, т. к. лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании.
Концентрация БАС, время уравновешивания, скорость потока.
Наносить следует разбавленные растворы БАС, т. к. то связано с диффузией в поры, стерическими затруднениями. Процесс аффинной хроматографии – процесс медленный, т. к. необходимо некоторое время для образования комплекса. Поэтому уменьшение числа теоретических тарелок приводит к увеличению эффективности. Иногда поток элюента останавливают на несколько часов и только потом начинают специфическое элюирование.
Неспецифические влияния.
Неспецифическая сорбция балластных веществ возможна вследствие ионного обмена или гидрофобных взаимодействий.