Хроматографический метод – физико-химический метод разделения компонентов сложных смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ, основанный на использовании сорбционных процессов в динамических условиях.
Классификация хроматографических методов:
По агрегатному состоянию подвижной и стационарной фазы.
| Стационарная фаза | Подвижная фаза | газ | жидкость |
| Твердая | Газо-адсорбционная | Адсорбционная, Ионообменная, Гельфильтрация, Аффинная | |
| Жидкая | Газо-жидкостная | Распределительная | |
Газо-адсорбционная хроматография – разделение смеси газов на твердом сорбенте. В качестве сорбента используют активный уголь, силикагель, цеолиты и т.д. В качестве газа-носителя используют аргон, воздух, гелий, водород.
Газо-жидкостная хроматография – разделение газовой смеси вследствии различной растворимости компонентов пробы в жидкости. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной фазой газ. По существу это вариант распределительной хроматографии.
По механизму разделения.
Адсорбционная, распределительная, ионообменная, гельфильтрация, аффинная хроматография.
По аппаратурному оформлению.
Колоночная: хроматография на открытых колонках, хроматография низкого давления, хроматография высокого давления.
Хроматография низкого давления, хроматография высокого давления.
Гидравлическая схема любого хроматографа включает в себя насос, дозатор, колонку и детектор.
Основное назначение насосов в ВЭЖХ состоит в создании стабильного потока элюента при установленном в определенном диапазоне расходе и обеспечении давления, необходимого для пропускания элюента при этом расходе через колонку. Имеется два принципиально различных типа насоса: постоянного давления и постоянного расхода. Первый тип насоса поддерживает установленное постоянное давление на входе в колонку, а расход определяется ее сопротивлением. Второй тип насоса поддерживает постоянный расход элюента, а давление на входе в колонку определяется ее сопротивлением.
Основными характеристиками насосов являются: максимальное давление, диапазон расходов, стабильность поддержания расхода или давления, инертность по отношению к элюенту и пробе, простота сборки и разборки.
Стабильность потока элюента непосредственно влияет на погрешность и воспроизводимость результатов анализа, а также на уровень флуктуационных шумов нулевого сигнала некоторых типов детекторов. В целях сглаживания пульсаций в современных насосах применяют различные демпферирующие устройства, многоголовочные системы поршневых насосов, а также микропроцессорный контроль пульсаций. Так как насосы в жидкостной хроматографии должны работать с любыми элюентами в дипазоне рН от 3 до 10, в том числе с кислотами, растворами солей агрессивными органическими жидкостями, высокие требования, как правило предъявляются к конструкционным материалам насосов.
Наилучшим материалом для корпуса насоса служит титан и его сплавы с палладием или цирконием. Допускается использование коррозионно-стойкой стали. Для плунжеров и шариковых клапанов наилучшим материалом являются лейкосапфир и рубин. Сальники обычно изготавливают из фторопласта или полиимида. Детали насосной системы, контактирующие с элюентом, должны соединяться переходниками из тех же материалов, из которых изготовлен насос. Применение сварки и пайки не допускается.
Насос постоянного давления с пневмогидравлическим усилителем. Расход элюента зависит от заданного входного давления воздуха и сопротивления колонки. Такой насос может быть легко модифицирован для работы при давлениях до 100 МПа. В этом случае с помощью него можно проводить упаковку колонок различного диаметра и длины.
К насосам постоянного расхода относятся шприцевые, поршневые, мембранные.
Шприцевой насос обеспечивает постоянный расход элюента без пульсаций. Насос однократного заполнения, по этой причине возникают трудности с быстрой сменой элюента.
Принцип действия насоса возвратно-поступательного типа с одним плунжером основан на вытеснении определенного объема жидкости из камеры насоса с помощью плунжера, который приводиться в действие эксцентриком от двигателя насоса. Насос на входе и выходе имеет обратные шариковые клапаны. Для надежной работы насоса необходимо полное отсутствие в элюенте твердых взвешенных частиц и пузырьков воздуха. Для устранения частиц применяют пористые фильтры, а для устранения воздуха растворители дегазируют.д.ля сглаживания пульсаций применяют демпферирующие устройства, а также двухплунжерные насосы (сдвиг работы плунжеров на 180) и трех плунжерные (сдвиг работы плунжеров на 120).
Одной из модификаций одноплунжерного насоса является мембранный насос. Давление создаваемое плунжером в камере насоса, заполненной инертной малолетучей жидкостью, передается на мембрану, которая вытесняет элюент через обратный клапан.
Требования к системе ввода пробы:
Вносить минимальное размывание хроматографических пиков;
Обеспечивать максимальную точность и воспроизводимость;
Сохранить неизменность количественного и качественного состава смеси до и после дозирования.
Способы ввода пробы
С остановкой потока и без остановки потока.
С остановкой потока – через вращающийся кран или через мембрану. Через мембрану лучше остановить поток, т. к. это не требует специальных шприцов для высокого давления. Мембрана набухает от растворителя, выкрашивается вследствие частых уколов в нее шприцом.
Без остановки потока через вращающийся кран. Петля обеспечивает постоянный объем, который попадает в колонку.
Хроматографическая колонка является одним из основных узлов хроматографа; ее задача – разделение смеси на отдельные компоненты.
Принято считать, что наибольшая эффективность колонки достигается в том случае, когда скорость прохождения потока через слой сорбента примерно равна скорости молекулярно диффузии в поры частиц. Коэффициент диффузии растворенного вещества в подвижной фазе зависит от типа сорбата, так и от типа и свойств используемого растворителя. Диффузия тем больше, чем ниже вязкость растворителя и чем меньше размер молекул растворенного вещества. Переход к использованию более мелких частиц в жидкостной хроматографии привел к уменьшению влияния внешне диффузионных процессов, но одновременно выдвинул требование существенного улучшения однородности слоя упакованных частиц.
Для оценки эффективности колонки используется понятие высоты теоретической тарелки.
Специфические и неспецифические.
Чувствительность детектора
Предел детектирования
Пределом детектирования называется минимальное содержание вещества в подвижной фазе, доступное обнаружению хроматографическим детектором. Принято считать предел детектирования равным удвоенной амплитуде шумов.
Уровень флуктуационных шумов.
Определяется как расстояние между крайними положениями нулевой линии за определенное время и при частоте флуктуаций не менее 0,05 Гц.
Наиболее распространенными детекторами в жидкостной хроматографии являются оптические детекторы: Абсорбционные 190нм-380нм, 380 – 800нм; инфракрасные детекторы 800 –5000нм; рефрактометрические; эмиссионные, флуорометрические; хемолюминесцентные.
Ультрафиолетовый детектор (специфичный) определяет зависимость степени поглащения света от концентрации пробы в проточной ячейке. Эта зависимость имеет линейный характер и определяется законом Бугера-Ламберта-Бэра.
Требования к растворителям:
не поглощать, свобода от примесей, прозрачность.
Инфракрасный детектор может служить может служить для идентификации природы органических соединений, так как многие группы органических веществ имеют характеристические полосы поглащения
Рефрактометрический детектор. (не специфичный) Принцип действия основан на дифференциальном изменении показателя преломления чистого растворителя и анализируемого раствора. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества.
Флуориметрический детектор. (специфичный)
Принцип действия основан на измерении излучения поглощения света в виде флуоресценции. Поглощение обычно проводят в УФ-области при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение фиксируют через фильт, не пропускающий лучи возбуждения. Длина волны флуоресцентного излучения всегда выше длины волны поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности, ФД более чувствительны, чем детекторы поглощения.
Параметры хроматограммы.
tR – время удерживания. Складывается из времени пребывания вещества в подвижной и неподвижной фазах. (формула)
tM – время пребывания молекул в подвижной фазе (мертвое время).
t’R – время пребывания молекул в неподвижной фазе.
t’R/ tM –характеризует взаимодействие разделяемых компонентов и хроматографической системы. В равновесных условиях отражает относительное количество молекул разделяемого вещества, находящихся в подвижной и неподвижной фазах. Поэтому отношение получило название отношения распределения масс, но более распространенное название – коэффициент емкости (коэффициент извлечения).
k= (tR-tM)/tM
Значение k может изменяться от нуля до бесконечности.
Отношение коэффициентов емкости компонентов смеси называют коэффициентом разделения a, или селективностью.
a=k2/k1
На описанные выше параметры отрицательно влияет размывание зон отдельных компонентов, обусловленное диффузионными процессами. Размывание хроматографических зон обусловлено в основном тремя следующими причинами: