3. Присоединить к колонке фитинг «к детектору», соединить его тефлоновым капилляром с мерным цилиндром вместимостъю 100 мл.
4. Собрать резервуар, присоединить его снизу к насосу капилляром и закрепить в тисках за верхний фитинг.
5. Тщательно перемешать силикагель и метанол, встряхивая И обрабатывая в ультразвуковой ванне колбу 3—4 мин.
6. Проверить, все ли ключи, колонка и воронка для заливания суспензии находятся в удобном положении и на месте.
7. Выключить ультразвуковую ванну, тщательно перемешать суспензию и через воронку залить ее в резервуар.
8. Немедленно присоединить колонку к верху резервуара, затянуть гайку ключом и подать метанол при давлении 20—50 МПа. Если течи нет, продолжать подачу растворителя до тех пор, пока в мерном цилиндре не соберется 80 мл метанола.
9. Выключить насос, подождать 1—4 мин до полной остановки потока, отсоединить верхний тефлоновый капилляр.
10.Отвернуть нижнюю гайку колонки, осторожно отсоединить колонку от резервуара, снять излишки силикагеля с торца колонки бритвой (если при разъеме образовался «кратер» на торце колонки—заполнить его шпателем из слоя уплотненного силикагеля с верха резервуара и срезать бритвой).
11.Установить фитинг «к инжектору».
12.Поставить заглушки на фитинги колонки, установить табличку с указанием направления потока сорбента, номера колонки, даты заполнения и т.п.
В таком виде колонку хранят до тестирования или работы с выбранным растворителем.
II Набивку проводят при направлении потока «сверху вниз», используя растворители повышенной вязкости.
1. Взвесить в конической колбе вместимостью 100 мл 4— 4,2 г силикагеля, добавить 50 мл 20%-ного раствора глицерина в метаноле.
2. К колонке присоединить фитинг «к детектору», установить заглушку, присоединить к резервуару колонку и предколонку и закрепить в тисках для подачи растворителя «сверху вниз».
3. Заполнить колонку раствором глицерина в метаноле.
4. Приготовить суспензию, тщательно перемешав силикагель и растворитель и поместив колбу на 5 мин в ультразвуковую ванну.
5. Залить суспензию в резервуар, долить до верха раствором глицерина в метаноле, чтобы не оставалось воздуха, завернуть фитинг резервуара и присоединить к нему капилляр от насоса.
6. Снять заглушку с колонки и сразу подать воду насосом под давлением 70 МПа.
7. Через 4—5 мин (для сорбента с частицами 10 мкм) вся суспензия будет продавлена через колонку. Подачу воды прекратить, дать давлению упасть до атмосферного и отсоединить колонку с предколонкой.
8. Отсоединить предколонку, выравнять сорбент на торце колонки шпателем и присоединить фитинг «к инжектору».
9. Пропустить через колонку 200 мл абсолютного метанола для удаления воды и глицерина.
10. Поставить заглушки на колонку и установить табличку с данными колонки. III Набивку проводят при направлении потока «сверху вниз», используя
растворитель сбалансированной плотности.
1. Взвесить в конической колбе вместимостью 100 мл 4— 4,2 г силикагеля, добавить 50 мл растворителя (60% масс. тетрабромэтана и 40% масс. тетрахлорэтилена).
2. К колонке присоединить фитинг «к детектору», установить заглушку, присоединить предколонку, заполнить колонку и предколонку тем же растворителем, присоединить к резервуару и закрепить в тисках для подачи растворителя «сверху вниз».
3. Приготовить суспензию, тщательно перемешав силикагель и растворитель и поместив колбу на 5 мин в ультразвуковую ванну.
4. Залить суспензию в резервуар, осторожно долить до верха гептаном, не оставляя воздуха.
5. Завернуть фитинг резервуара, присоединить капилляр от насоса, снять заглушку колонки и немедленно подать гептан насосом под давлением 50 МПа.
6. Прекратить подачу растворителя и дать давлению упасть до нуля как только вся суспензия будет продавлена через колонку и появится гептан.
7. Отсоединить колонку с предколонкой, отсоединить предколонку, выравнять слой силикагеля на торце колонки и присоединить фитинг «к инжектору».
8. Пропустить через колонку 200 мл абсолютного метанола.
9. Поставить на колонку заглушки и табличку с ее данными.
Все три метода дают возможность получить колонки с силикагелем, заполненные однородно и обеспечивающие высокую эффективность разделения. С сорбентом зернением 10 мкм удается получить колонки длиной 25 см, имеющие эффективность обычно от 4 до 8 тыс. т. т., имеющих приведенную высоту теоретической тарелки от 3 до 6. При использовании имеющихся в продаже не очень узко сепарированных сорбентов это является хорошим результатом. Если использовать очень узкие фракции силикагеля и хорошо их обеспылить седиментацией, удается получить колонки с эффективностью до 12 тыс. т. т., имеющих приведенную высоту теоретической тарелки, приближающуюся к 2.
Значительно сложнее набивка колонок сорбентами с химически привитыми фазами. Выбор методики заполнения колонок такими сорбентами основывают на использовании данных по набивке фирмы-производителя или применяют оригинальные методики, описанные в литературе.
Последние являются наиболее надежными, но зачастую не содержат подробностей, и поэтому дают неудовлетворительные результаты при попытке их воспроизвести. Так как химия поверхности сорбентов с привитыми фазами, особенно обращенно-фазных, сложна, можно обсуждать метод упаковки только конкретного сорбента. Попытка применить описанный в литературе или использовавшийся исследователем метод упаковки другого сорбента «с той же химически привитой фазой на той же матрице» (например, октадецилхлорсилан, привитый к силикагелю), как правило, приводит к неудаче и только как исключение — дает хороший результат.
Опыт автора подтверждает, что даже для новых партий одного сорбента той же фирмы может потребоваться серьезная корректировка методики заполнения колонок, так как химия их поверхности различается в деталях от партии к партии. Надо также учитывать тот факт, что фирмы, производящие и колонки, и сорбенты, не заинтересованы в разглашении секретов упаковки своих сорбентов. Следует с осторожностью относиться к «чудодейственным» жидкостям для приготовления суспензий обращенно-фазных и некоторых других сорбентов, составы которых не раскрываются фирмами-производителями. Утверждения об «универсальности» этих жидкостей для любого обращенно-фазного сорбента и о получении «гарантированно высокоэффективных» колонок являются не более, чем рекламой. Она нередко весьма далека от реальных результатов, которые удается получить, а воспроизвести их состав в случае успеха (особенно если речь идет о полном составе) довольно затруднительно.
1.3 ЗАПОЛНЕНИЕ КОЛОНОК «СУХИМ» МЕТОДОМ
Заполнение колонок «сухим» способом возможно только старыми поверхностно-пористыми (пелликулярными) сорбентами, имеющими размер частиц 35—60 мкм, а также пористыми сорбентами на основе силикагеля с размером частиц 25—40 мкм и больше. Колонки, заполненные сорбентами первого типа, имеют невысокую эффективность по сравнению с колонками, заполненными современными сорбентами с размером частиц 5—10 мкм, и имеют малую емкость по пробе. Колонки с сорбентами второго типа также имеют невысокую эффективность, но допускают значительно большую нагрузку пробой и применяются для препаративной работы. Из-за действия поверхностных сил не удается эффективно упаковать колонку сухим способом микрочастицами размером 3—20 мкм.
Заполнение колонок сухим способом проводят следующим образом.
1. Колонку тщательно промыть растворителями и высушить, присоединить концевой фитинг «к детектору».
2. К свободному концу колонки присоединять (на резьбе или с помощью резиновой трубки) небольшую воронку.
3. Засыпать сорбент в колонку через воронку небольшими порциями, достаточными для заполнения колонки на 2—4 мм по высоте; колонку при этом держать вертикально.
4. Уплотнить сорбент, осторожно постукивая колонкой по деревянной поверхности, медленно вращая ее и постукивая деревянной палочкой по стенке колонки примерно на уровне слоя сорбента. Постукивать колонкой несколько раз по деревянной поверхности без постукивания по стенке.
5. Добавить следующую порцию и повторять все операции, пока колонка не заполнится доверху.
6. Несколько минут осторожно постукивать заполненной колонкой по деревянной поверхности, не постукивая по стенке.
7. Отсоединить воронку, выровнять слой сорбента и установить фитинг «к инжектору».
Некоторые авторы рекомендуют использовать механическую вибрацию в комбинации с ручным вращением и постукиванием по стенке колонки, другие — комбинировать механическую вибрацию и вращение на специальном стенде.
1.4 ТЕСТИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПРИГОТОВЛЕННЫХ КОЛОНОК
Приготовленные колонки тестируют на модельной смеси веществ и стандартных растворителях с целью оценки их качества.
Для тестирования колонок c силикагелем, привитыми фазами «нитрил» и «диол» рекомендуется растворитель гексан — изопропанол (100:2 по объему), проба —по 0,5% (масс.) о-крезола и фенола в растворителе.
Для тестирования колонок с обращенно-фазными сорбентами (С2, C8 и C18) рекомендуется растворитель метанол—вода или ацетонитрил—вода (70:30 по объему), проба — по 0,5% (масс.) толуола и n-ксилола в метаноле (ацетонитриле). Если компоненты пробы выходят слишком быстро (для обращенно-фазных сорбентов с малым содержанием привитой фазы), растворитель следует заменить на новый с соотношением компонентов 50:50.
Новая колонка, как правило, содержит растворитель набивки, отличающийся от растворителя тестирования по составу. Поэтому новую колонку устанавливают на хроматограф и подают растворитель тестирования со скоростью 1 мл/мин для колонок диаметром 4,6 мм (стандартных, аналитических). Время, в течение которого устанавливается равновесие колонки с новым растворителем, определяется по стабильности нулевой линии детектора и параметров удерживания тест-веществ и обычно колеблется от 1 до 2 ч. После установления равновесия вводят несколько раз тест-смесь и получают тест-хроматограммы.