Масс-спектрометрический метод анализа (стр. 7 из 9)
Очень полезной особенностью ионных ловушек является то, что они способны изолировать один вид ионов, выпустив все остальные из ловушки. Изолированные ионы могут быть, затем фрагментированы посредством столкновений, а фрагменты проанализированы. Основное преимущество квадрупольных ионных ловушек – то, что эксперимент с диссоциацией, вызванной многократными столкновениями, может быть проведён быстро без использования дополнительных анализаторов, так, что LC-MS/MS в реальном времени сейчас является обычным делом. Другими важными преимуществами квадрупольных ионных ловушек являются малые размеры и их способность ловить и накапливать ионы для обеспечения лучшего ионного сигнала.Квадрупольные ионные ловушки были приспособлены для ряда различных целей: от EI-MSn (рис. 2.5) биомолекул до их более современных совмещений с MALDI. MSn позволяет многократным MS/MS экспериментам проводиться с последовательными фрагментарными ионами, давая дополнительную фрагментарную информацию. Но главнейшим применением ионных ловушек является определение белков. LC-MS/MS эксперименты проводятся для белковых гидролизатов, давая информацию одновременно по MS и MS/MS. Эта информация позволяет идентифицировать белки и характеризовать пост-трансляционную модификацию. Диапазон масс (~4000 m/z) коммерческих LC-ловушек хорошо соответствует значениям m/z, генерируемым ионизацией электроспрея пептидов, а разрешение позволяет идентифицировать зарядное состояние многозарядных ионов пептидов. Масс-спектрометры квадрупольной ионной ловушки могут анализировать пептиды из трипсинового гидролизата при их содержании порядка 20-100 фмоль. Другим ценным качеством техники ионной ловушки для анализа пептидов является её способность проводить несколько стадий масс-спектрометрии, которые значительно увеличивают количество структурной информации. [13]
Линейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа. 
Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон.
Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов.
Двуфокусирующий магнитный сектор
Первые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m/z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m/z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и
 |
MALDI. [14]
Квадрупольная-времяпролётная тандемная масс-спектрометрия
Линейный времяпролётный (TOF) анализатор масс (рис. 2.7) является простейшим анализатором масс. Он пережил возрождение с изобретением MALDI и его текущее применения для электроспрея и даже газовой хроматографии с масс-спектрометрией электронной ионизацией (GC/MS). Времяпролётный анализ основан на ускорении группы ионов по направлению к детектору, при котором всем ионам сообщается одинаковая энергия при помощи ускоряющего потенциала. Так как ионы имеют одинаковую энергию, но разную массу, лёгкие ионы достигают детектора первыми из-за их большей скорости, в то время как тяжёлые ионы летят дольше из-за их большей массы и, соответственно, более низкой скорости. Поэтому анализатор был назван времяпролётным, потому что масса в нём определяется по времени прибытия ионов. Масса, заряд и кинетическая энергия – всё это вносит свой в клад в время прибытия иона к детектору. Так как кинетическая энергия (KE) иона равна ½ mv2, скорость иона может быть представлена как v = d/t = (2KE/m) ½. Ионы проходят расстояние d за время t, а t зависит от m/z. В этом уравнении v = d/t = (2KE/m) ½, принимая z = 1. Другим представлением этого уравнения, более чётко показывающим, как определяется масса, является m=2t2KE/d2, где KE=const.
Времяпролётный рефлектрон (рис. 2.8) сейчас широко используется для ESI, MALDI, а в последнее время и для приложения электронной ионизации для ГХ/МС. Он комбинирует времяпролётную технологию и электростатическое зеркало. Рефлектрон служит для увеличения времени (t), которое нужно ионам, чтобы достичь детектора, при этом уменьшая распределение кинетической энергии, тем самым уменьшая временное распределение Δt. Так как разрешение определяется как масса пика, делённая на его ширину или m/Δm (или t/Δt, так как m пропорциональна t), увеличение t и уменьшение Δt приводит к росту разрешения. Поэтому TOF рефлектрон даёт более высокое разрешение по сравнению с простым прибором TOF посредством увеличения длины пути и фокусировки энергии посредством рефлектрона. Нужно отметить, что увеличенное разрешение (обычно выше 5000) и чувствительность на TOF рефлектроне значительно уменьшается при высоких массах (обычно при m/z свыше 5000).
Другим типом тандемного анализа масс, MS/MS, является также возможное комбинирование MALDI и TOF рефлектрона. MS/MS осуществляется с особенности MALDI – фрагментации, которая происходит после ионизации, или распадом после источника (PSD). Времяпролётные приборы сами по себе не разделяют пост-ионизационные фрагментарные ионы от одного и того же иона-прекурсора, потому что и прекурсор, и фрагментарные ионы имеют одинаковую скорость и поэтому достигают детектора в одно и то же время. Рефлектрон даёт преимущество в том, что фрагментарные ионы имеют разную кинетические энергии и разделяются на основании того, как глубоко ионы проникают в поле рефлектрона, тем самым давая спектр фрагментарных ионов (рис. 2.9 и 2.10).
Нужно заметить, что электроспрей также был адаптирован под TOF рефлектронные анализаторы, в которых ионы из непрерывного ESI-источника накапливаются в гексаполярном (или октаполярном) ионопроводе, а затем выталкиваются в TOF анализатор. Тем самым, необходимая электростатическая импульсность создаёт точку отсчёта, с которой можно начинать измерения TOF.
MALDI и времяпролётный анализ
На начальных этапах развития MALDI-TOF, эти приборы имели относительно низкое разрешение, которое серьёзно ограничивало их точность. Нововведением, которое оказало существенный эффект на увеличение разрешающей силы MALDI времяпролётных приборов было отложенное извлечение (DE), как показано на рис. 2.11. В теории, отложенное извлечение означает просто охлаждение и фокусировку ионов сразу после акта MALDI, но на практике сначала было проблемой включать и выключать импульсы в 10000 вольт за наносекунды.
В традиционных приборах MALDI, ионы ускоряются из устройства ионизации сразу после образования. Однако, отложенное извлечение ионов позволяет им «остыть» в течение ~150 наносекунд перед ускорением в анализатор. Этот период охлаждения генерирует набор ионов с гораздо меньшим распределением кинетической энергии, значительно уменьшая временной разброс ионов, когда они входят в TOF анализатор. В общем, это приводит к увеличению разрешения и точности. Выгоды отложенного извлечения значительно сокращаются для больших макромолекул, таких как белки (>30000 Да). [3]