Производство глутаминовой кислоты (стр. 2 из 3)
Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Вероятно, это связано с изменением липидного состава клеточных мембран, что способствует увеличению проницаемости клеточных мембран для глутаминовой кислоты. Присутствие такого рода стимуляторов позволяет вести ферментацию с большим выходом глутаминовой кислоты при повышенных концентрациях биотина. Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01–0,2% или калиевой соли бензилпенициллина повышают биосинтетическую способность продуцента на 15–45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50г/л. [2]
В качестве источника азота в питательных средах чаще всего используют мочевину в количестве до 1,5–2,0% в зависимости от особенностей используемого штамма, но вводится она дробно, по мере потребления ее из среды, и так, чтобы содержание ее в культуралыюй жидкости не превышало 0,8% и рН среды было в пределах от 6,8 до 7,8.
Недостаток азота в среде приводит к снижению синтеза глутаминовой кислоты и к накоплению в среде повышенных количеств α-кетоглутаровой кислоты.
Для нормального роста культуры и образования ею глутаминовой кислоты необходимо вводить в среду соли калия в виде КН2РО4 до 0,1-
для поддержания рН среды на оптимальном уровне – около 7–7,2. Длительность культивирования зависит от содержания сухих веществ в среде, способа введения компонентов среды (единовременно или дробно), степени аэрации среды и, конечно, от физиологических особенностей продуцента. [2]
5. Изложение технологического процесса
5.1 Приготовление питательной среды
Для промышленных штаммов Coryn. glutamicum питательные среды при производстве посевного материала, как правило, содержат следующие компоненты (в%) [2]:
Таблица 3
| Состав питательной среды (в%) | |
| Меласса | 8 |
| Кукурузный экстракт | 0,3 |
| Хлорид аммония | 0,5 |
| Калия фосфат двухзамещенный | 0,05 |
| Сульфат магния | 0,03 |
| Вода | остальное |
| рН среды | 7,0–7,2 |
Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же компоненты и в том же количестве, только вместо кукурузного экстракта и сульфата аммония присутствует до 2% мочевины, содержание мелассы увеличивают до 20%, дополнительно вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. [2]
5.2 Стерилизация питательной среды, аппаратов и коммуникаций
Подготовку ферментаторов (инокуляторов) к работе начинают с промывки использованного оборудования горячей и холодной водой с последующей обработкой аппаратов и коммуникаций острым паром. Стерилизацию питательных сред осуществляют традиционным способом, так же как и подготовку технологического воздуха. Растворяемые компоненты среды нагревают до определенной температуры, затем выдерживают при этой температуре с последующим охлаждением до температуры ферментации.
Питательная среда для выращивания продуцентов глутаминовой кислоты состоит из мелассы, кукурузного экстракта или другого источника ростовых веществ, мела и пеногасителя. Питательная среда готовится и стерилизуется в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизация среды состоят из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре в течение 1 часа и охлаждения до температуры, при которой проводится культивирование продуцента глутаминовой кислоты.
Термолабильные компоненты среды, например мелассу, содержащую сахарозу стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу и нагревают ее при постоянном размешивании до температуры 80°С, с периодическим добавлением к раствору определенного количества воды. Собственно стерилизацию осуществляют путем быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120–122°С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели всей микрофлоры. Охлажденный раствор сжатым стерильным воздухом передают в предварительно подготовленный ферментатор. Температура стерилизации мелассы выше, а длительность значительноменьше, чем те же параметры при стерилизации остальных компонентов среды.
Пеногаситель, используемый на стадиях культивирования продуцента в посевном аппарате и основном ферментере, особенно в том случае, когда им является масло или жир, стерилизуется отдельно. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред.
Процесс получения глутаминовой кислоты требует строгих асептических условий, и поэтому особое внимание уделяется стерилизации не только среды, но и всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха.
При стерилизации аппаратуры режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлено оборудование и его отдельные узлы. Наибольшая эффективность стерилизации аппаратуры и коммуникаций наблюдается при применении острого пара, имеющего температуру 135–140°С.Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и потому в этих случаях могут применяться «холодные» способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридинового бромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенола и их смеси, аммонийные соли первичных и вторичных алкилсульфатов, хлорсодержащие соединения, |3-пропиоллактон и т.д.).
Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций может быть проверена. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате сутки. Если среды остаются стерильными, то стерилизация проведена качественно. Такой анализ проводится при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях. [2]
5.3 Приготовление исходной и посевной культуры
Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращивании продуцента в посевном аппарате в питательную среду вносят до 0,1% стерильного синтетического пеногаситсля.
Накопление биомассы до 6–8 г. АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, потом в посевных аппаратах объемом 5 м. Полученный посевной материал в количестве 5–6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы на 50 м3. Коэффициент заполнения аппарата 0,7. [2]
5.4 Выращивание продуцента в ферментаторе
Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48–52 ч и интенсивной аэрации [80–85 мг Ог/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28–30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 45 г./л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45–50%.
Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, последующая технологическая схема предусматривает производство продуктов, подготовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм.
Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости и последующая очистка ее в соответствии с требованиями фармакопеи
предполагает такую последовательность проведения технологических операций. [2]
5.5 Предварительная обработка культуральной жидкости
Осуществляется в результате добавления к ней определенного количества негашеной извести (или известкового молока) с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей. [2]
5.6 Отделение биомассы от культуральной жидкости
Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением. [2]
5.7 Осветление фильтрата
Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1. [2]
5.8 Концентрирование осветленного раствора глутаминовойкислоты
Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40–60 °С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды. [2]
5.9 Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты визоэлектрической точке
Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и охлаждения раствора до 4–15°С. Однократное проведение операции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты; при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемых кристаллов достигает 88%.
В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи. [2]