Фосфолипазы, их классификация и свойства (стр. 3 из 7)

В неактивированных клетках концентрация внутриклеточного Са2+ обычно колеблется в пределах 30-100 нмоль/л. При активации различных рецепторов концентрация ионов Са2+ может достигать 1-3 мкмоль/л. В ряде работ было показано, что увеличение активности цитозольной ФЛА2 происходит в диапазоне концентраций ионов Са2+ 150-800 нмоль/л. При увеличении концентрации ионов Са2+ происходит миграция фосфолипазы к мембранам и её прикрепление к ним, после чего начинается гидролиз фосфолипидов.

Связывание фосфолипазы с мембраной происходит за счёт имеющегося в белке домена С2:

Домен С2 гомологичен подобным доменам протеинкиназы С, ГТФазы, и фосфолипазы С. Все эти белки связываются с мембранами в присутствии ионов Са2+. Наличие достаточных концентраций ионов Са2+ необходимо для ориентации фосфолипазы и её прикрепления. В отсутствие ионов Са2+ фермент сохраняет активность по отношению к растворимым субстратам, таким как 1-пальмитил-2-лизофосфатидилхолин.

В зависимости от типа агониста концентрация ионов Са2+ в клетке меняется по-разному. Одни агонисты вызывают её кратковременный рост внутри клетки; под действием этих агонистов концентрация ионов Са2+ после резкого подъёма возвращается к исходному уровню в течение 1-2 мин. Другие же вызывают продолжительный рост концентрации ионов Са2+, и повышенная концентрация ионов Са2+ сохраняется в клетке от 5-30 мин. На эпителиальных клетках было показано, что для устойчивого прикрепления ФЛА2 к поверхности биологических мембран необходима повышенная концентрация ионов Са2+ в течение 5 мин, а при кратковременном подъёме через 1-2 мин происходит обратная диссоциация белка в цитозоль без заметного высвобождения арахидоновой кислоты. Если же повышенная концентрация ионов Са2+ сохраняется в течение 5 мин и более, то цитозольная фосфолипаза ФЛА2 остаётся на мембране и гидролиз фосфолипидов продолжается даже после возврата концентрации внутриклеточного Са2+ к нормальным значениям.

Для проявления максимальной активности фосфолипазы при кратковременном увеличении концентрации ионов Са2+ внутри клетки необходимо также фосфорилирование белка киназами. В опытах in vitro было показано, что цитозольная фосфолипаза может быть фосфорилирована протеинкиназой С, митогенактивируемыми протеинкиназами р42/р44 или протеинкиназой А, но только фосфорилирование митогенактивируемыми протеинкиназами (MAPK) приводит к значительному увеличению активности фосфолипазы. Митогенактивируемые протеинкиназы фосфорилируют фосфолипазу по остатку Ser-505. В ряде случаев именно фосфорилирование определяет проявление активности фосфолипазы в клетке.

Таким образом, цитозольная фосфолипаза принимает участие как в регуляции синтеза эйкозаноидов при остром ответе клеток на различные провоспалительные стимулы, так и в ряде случаев при отложенном ответе. Основными факторами, регулирующими активность цитозольной фосфолипазы, являются концентрация внутриклеточного Са2+ и активность митогенактивируемых протеинкиназ. Активность фермента может значительно возрастать в течение первых минут после стимуляции клеток. Транслокация фермента при активации важна по двум причинам: 1) позволяет ферменту взаимодействовать с фосфолипидами мембраны; 2) доставляет селективную по арахидоновой кислоте липазу к месту расположения ферментов синтеза простагландинов (PG) и лейкотриенов (LT), т. е. потенциально возможно образование компартмента, в котором высвобождаемая арахидоновая кислота непосредственно метаболизируется далее.

2.2.1 Секреторные ФЛА2

Секреторные ФЛА2 имеют молекулярную массу около 14 кДа, характеризуются абсолютной необходимостью ионов Са2+ в миллимолярных концентрациях для каталитической активности, рН оптимум находится в интервале 7-9.

В настоящее время описано десять типов секреторной ФЛА2 (IВ, IIА, IIC, IID, IIE,IIF,III,V, X,XII) которые различаются первичной структурой и расположением дисульфидных мостиков. Все типы секреторных фосфолипаз представляют собой глобулярные белки, богатые цистеином (5-8 дисульфидных мостиков), что обеспечивает стабильность фермента, в том числе устойчивость к протеолизу и денатурации. Фермент не проявляет избирательности в отношении жирнокислотного состава фосфолипидов, но предпочтительно гидролизует отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидную кислоту и фосфатидилглицерол).

Долгое время была известна только одна ФЛА2, которая в изобилии присутствует в панкреатической жидкости (тип IB). В 1989 г. была открыта и клонирована фосфолипаза типа IIA, которая хранится в секреторных гранулах тромбоцитов и концентрация которой значительно увеличивается в местах воспаления, таких как синовиальная жидкость при ревматоидном артрите. Эти белки имеют большое сходство с белками яда змей. Среди белков ядов пчёл и ящериц были обнаружены другие фосфолипазы, которые отнесены к типу III. У млекопитающих белок, соответствующий этому типу, был обнаружен только в 2000 г.. Новый период в исследованиях секреторных фосфолипаз начался в 1994 г., когда были открыты белки типа IIC и V. Это открытие привело к пересмотру роли этого семейства белков в регуляции функций клеток и интенсивному поиску новых аналогичных белков. Были открыты белки типа X, IID, IIE и IIF, XII.

Все эти белки (кроме белка типа III) имеют молекулярную массу 14-17 кДа, содержат гистидин в каталитическом центре и проявляют фосфолипазную ктивность в присутствии миллимолярных концентраций кальция. Они имеют высококонсервативные аминокислотные последовательности в каталитическом участке (DXCCXXHD) и участке кальцийсвязывающей петли (XCGXGG), а также 6-8 консервативных сульфидных мостиков. В активном центре находится также аспартат, который совместно с кальцийсвязывающей петлей выполняет роль кармана для иона Ca2+.

Ферменты этого семейства не проявляют специфичности ни по отношению к группе, связанной с остатком фосфатидной кислоты, ни по отношению к ацильной группе в положении sn-2. Наличие в фосфолипидах окисленных форм жирных кислот увеличивает активность секреторных фосфолипаз, что предполагает их участие в регуляции вязкости мембран при окислительном стрессе. Из данных рентгеноструктурного анализа первых двух групп белков следует существование гидрофобного канала, в который входит молекула фосфолипида после межфазного связывания белка на фосфолипидной поверхности.

Секреторная ФЛА2 конститутивно содержится в различных клетках, участвующих в развитии иммунных и воспалительных ответов: макрофагах, тучных клетках, фибробластах и тканях таких органов, как печень, селезенка, тимус, костный мозг, кишечник. Активность фермента на уровне клеток регулируется за счет его индукции различными воспалительными стимулами (интерлейкин-1 и интерлейкин-6, фактор некроза опухоли,липополисахарид, интерферон-g, форболовые эфиры, фактор роста нервов). В соответствии с индукцией разнообразными стимуляторами промотер гена IIA содержит нуклеотидные последовательности TATA и CAAT, а также последовательности связывания таких факторов транскрипции, как AP-1, C/EBP, CREB, NF-kB, STAT, PPA Rg. В некоторых клетках экспрессия ФЛА2 зависит от предварительной активации цитозольной фосфолипазы PLА2a, при этом предполагается вовлечение в процесс регуляции фосфолипазы IIA продуктов 12/15- липоксигеназного пути. Глюкокортикоиды (стероидные противовоспалительные препараты) являются супрессорами экспрессии фосфолипазы IIA.

Изменение экспрессии фосфолипазы IIA во многих случаях связано с модуляцией простагландиновой ветви каскада арахидоновой кислоты. Так, при стимуляции интерлейкином-1 и фактором некроза опухоли активировался как синтез и секреция фосфолипазы, так и синтез простагландина Е2 и простациклина в мезангиальных или эндотелиальных клетках, соответственно. При добавлении к клеткам антител к фосфолипазе синтез простациклина частично подавлялся. Из результатов, полученных в последние годы, следует, что секреторные фосфолипазы (IIA и схожие с ней V, X) участвуют в процессах как быстрой, так и замедленной продукции арахидоновой кислоты и простаноидов.

Следует отметить, что добавление секреторных фосфолипаз во внеклеточную среду приводит к активному высвобождению арахидоновой кислоты и синтезу простаноидов активированными клетками, но практически не влияет на гидролиз фосфолипидов мембран покоящихся клеток.

Помимо роли фермента, ответственного за наличие арахидоновой кислоты, секреторные фосфолипазы могут выступать в роли физиологически активных веществ. Так, в тучных клетках специфические ингибиторы секреторных фосфолипаз уменьшали стимулированную фактором роста нервов экспрессию циклооксигеназы-2. При этом каталитически неактивные мутанты белка фосфолипазы также были способны вызывать экспрессию циклооксигеназы-2, т.е. этот эффект не зависит от ферментативных свойств фосфолипазы. Механизм этого процесса не ясен. Возможно, вовлекаются функции секреторной ФЛА2 как лиганда специфических рецепторов.

Действительно, в 1995 г. было показано, что существуют специфические белки, которые связываются с фосфолипазой типа IB (константа диссоциации образовавшегося комплекса 1 нмоль/л) и проявляют различные биологические эффекты. За последующие 10 лет обнаружено ещё много белков, растворимых и мембраносвязанных, которые способны связывать секреторную фосфолипазу. Однако свойства «классического» рецептора, который при связывании лиганда активирует систему внутриклеточной передачи сигнала, проявляет только один из этих белков. Это белок M-типа, или sPLA2R. Ген данного белка локализован во второй хромосоме; белковая последовательность имеет 75 % гомологии среди ряда видов млекопитающих; ген имеет 1 копию и ничем не похож на другие гены. Белок имеет молекулярную массу 180-200 кДа, значительная его часть расположена во внеклеточной области, в цитозоле находится последовательность из 40 аминокислотных остатков. Белок без этого цитозольного участка встречается в растворимой форме и показана его роль как ингибитора эффектов секреторных фосфолипаз. У человека белок экспрессирован в поджелудочной железе, лёгких и почках. Показана важная роль активации этого рецептора в развитии эндотоксического шока.