КУРСОВАЯ РАБОТА
Введение
Клеточная стенка – один их немногих клеточных компартментов, наличие которого принципиально отличает растительную клетку от животной. Казалось бы, она должна пользоваться особым вниманием биологов растений. Однако нет, пожалуй, другого столь масштабного и столь плохо понятого процесса как формирование клеточной стенки. Причин для такого положения вещей несколько. Важнейшая из них – сложность, ранее недооцененная, этой надмолекулярной структуры, в состав которой входят многочисленные полимеры с разнообразными деталями строения и неравномерной локализацией. Еще одна причина – упрощенное и несколько пренебрежительное отношение к клеточной стенке как к мертвому внеклеточному образованию, существовавшее на протяжении веков. Многим казалось, что клеточная стенка – своеобразный «ящик», в котором находится живая протоплазма. «Неживые части растительных тканей» – формулировка из определения апопласта, в понятие которого входила совокупность клеточных стенок растения.
Клеточная стенка «ожила» в результате исследований последних десятилетий. Из «мертвого деревянного ящика», в котором живет протоплазма, она превратилась в многофункциональный компартмент растительной клетки с исключительно сложными механизмами формирования и функционирования. Растительной клеточной стенке присущи дуалистичекие свойства. С одной стороны, она отделяет одну клетку от другой, создавая условия для компартментации растительного организма, а с другой стороны, именно клеточная стенка объединяет клетки в целый организм, организуя их взаиморасположение и обеспечивая апопластный путь транспорта. Клеточная стенка должна обладать прочностью, чтобы выносить большие механические нагрузки, и в то же время быть способной растягиваться, во всяком случае, на некоторых этапах развития клетки. Клеточная стенка участвует в определении направления и скорости растяжения клетки, в реакции на стресс, в формировании водо- и ион-связывающей способности ткани, в механизмах узнавания клеток, в частности клеток патогенов, в обеспечении прорастания семян, созревания фруктов, опадения листьев, наконец – в образовании регуляторных молекул олигосахаринов. В последние годы достигнуты колоссальные успехи в расшифровке молекулярной структуры компонентов клеточных стенок, прежде всего полисахаридов, которые относятся к числу наиболее сложных молекул биологического происхождения. Необозримая информационная емкость клеточной стенки не нашла пока своей расшифровки, но уже сейчас очевидно, что эта субклеточная структура – значительно более динамичное образование, чем было общепризнанно.
Целлюлоза является веществом, широко распространенным в растительном мире. Вопрос об условиях и механизме биохимического синтеза целлюлозы – один из наиболее сложных и интересных в химии целлюлозы.
Роль целлюлозы, основного компонента клеточной стенки высших растений, играющего роль механического каркаса, непосредственно связана с особенностями химического строения макромолекулы и характером надмолекулярной структуры. Как образование макромолекул целлюлозы, так и формирование надмолекулярной структуры происходит в процессе биохимического синтеза, поэтому проблема исследования образования целлюлозы в природе имеет два аспекта – собственно биохимический, включающий вопрос о характере исходных реагирующих соединений, кинетике и механизме синтеза макромолекул, и структурно-химический механизм образования элементов надмолекулярной структуры и формирования сложной структуры полисахарида как полимера.
Возможность рационального использования целлюлозы различных отраслях народного хозяйства для получения материалов обладающих требуемыми свойствами, непосредственно зависит от выяснения основных вопросов строения целлюлозы и от подробного изучения свойств целлюлозных материалов. Это относится в первую очередь к тем отраслям промышленности, которые основаны на химической переработке целлюлозы (приготовление лаков, пленок, пластических масс, искусственного волокна, бездымного пороха и т.д.), а также к текстильной и бумажной промышленности. Разные представления о строении целлюлозы приводят к разным выводам об оптимальных условиях проведения процессов ее химической переработки и о методах, которые нужно применять для изменения в желаемом направлении физико-химических и механических свойств получаемых продуктов. Поэтому, естественно, вопросам строения целлюлозы посвящались и посвящаются многочисленные исследования.
В настоящее времени отсутствуют эффективные методы нативного выделения прочно связанных полисахаридов из клеточной стенки, что очень сильно препятствует изучению структуры клеточной стенки.
Проведённые в нашей лаборатории исследования позволили разработать метод выделения прочно связанных с клеточной стенкой матриксных полисахаридов в нативной форме, что позволило проводить более результативные исследования.
Целью данной работы является выделение и моносахаридный анализ прочно связанных полисахаридов с целлюлозой из клеточной стенки ксилемы льна.
Задачи
1) Отчистить клеточную стенку от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.
2) Получить раствор прочносвязанных с целлюлозой полисахаридов.
3) Разделить фракций по молекулярным массам.
4) Провести моносахаридный анализ.
1. Обзор литературы
1.1 Растительная клеточная стенка
Растительная клеточная стенка была первой субклеточной структурой, увиденной учеными. Именно ее обнаружил в 1665 г. Роберт Гук при наблюдении в микроскоп среза пробкового дерева (см. Полевой, 1989, с. 13). И название «клетка» относилось первоначально именно к этой структуре из-за сходства строения исследуемых под микроскопом частей растений с ячейками («cells») пчелиных сот. Протоплазма была открыта позднее и терминологическая путаница при употреблении слова «клетка» долгое время смущала ученых (Кернер, 1906 с. 26).
В большинстве многоклеточных организмов, клетки погружены в специальный матрикс, который обеспечивает целостность клеток, и оказывает влияние на их форму, развитие и полярность. Но только в растительных клетках он, во-первых, настолько структурирован, что получил название стенки, а во-вторых, отличается огромным разнообразием компонентов, у которых детерминированы разнообразные детали строения и локализации. Ключевые различия между клетками растений и животных в отношении роста, формообразования, питания, развития, репродукции и защитных механизмов связаны именно с наличием клеточной стенки.
Размеры клеточной стенки
Клеточная стенка – слой структурированного материала, расположенного снаружи от плазмалеммы. Ее толщина обычно колеблется в пределах 0,1–10 мкм (Fry, 1988, с. 2).
Клеточная стенка составляет весьма значительную часть растительного организма: ее содержание в травянистых растениях составляет от 30 до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 80–90%. Основные компоненты растительной клеточной стенки – самые распространенные органические соединения на Земле.
Объем клеточной стенки резко отличается в различных тканях. Однако даже в растущих клетках с тонкой клеточной стенкой ее объем может составлять до 10% объема клетки, а в сформированных тканях – до 90%.
Клеточная стенка – мощный потребитель фотосинтетических ассимилятов. Именно компоненты клеточной стенки, в первую очередь целлюлозу и лигнин, которые в растительном организме практически никогда не расщепляются, можно рассматривать как конечные продукты фотосинтеза. Затраты клетки на создания клеточной стенки необходимы для образования субстратов синтеза ее компонентов, их транспортировки по растению и внутри клетки, формирования сложного ферментативного комплекса, энергетических расходов.
1.2 Состав клеточных стенок
Основным компонентом клеточных стенок, значение которого часто недооценивается, является вода. Матрикс клеточной стенки на 75% состоит из воды и напоминает плотный водный гель (Cosgrove, 1997). Важной характеристикой клеточной стенки является ее рН. Различные методы определения обычно дают значения рН между 4 и 5 (Fry, 1988; Peters, Felle, 1991; Rayle, Cleland, 1992; Schopfer, 1993). Однако уникальность свойств клеточной стенки определяется присутствующими в ней полимерами, среди которых полисахариды, фенольные соединения (лигнин), белки.
Номенклатура полисахаридов построена так, что последним в слове называются формирующие остов молекул моносахара, к корню которых добавляется суффикс – ан. Например, «ксилан», если остов из ксилозы, «глюкан», если остов из глюкозы и т.д. Перед названием остова ставятся названия тех моносахаров, которые встроены в боковые цепочки. Например, «глюкуроноксилан», если к остову из ксилозы присоединены боковые звенья из глюкуроновой кислоты. Правда, структура полисахаридов значительно разнообразнее, чем можно изобразить словесными построениями; с примерами этого мы столкнемся, разбирая ниже структуру отдельных полисахаридов.
Полисахариды клеточной стенки подразделяют на три класса: 1) целлюлоза; 2) связующие гликаны (раньше называли гемицеллюлозы); 3) пектиновые вещества. Эта терминология в настоящее время наиболее распространена, хотя и достаточно условна, поскольку названия основаны на разных принципах, а граница между вторым и третьим классом несколько размыта. К первому типу относится, единственный полисахарид – целлюлоза. Название второго класса полисахаридов клеточной стенки определяется тем, что они связывают между собой микрофибриллы целлюлозы. Этот термин применяют ко всем нецеллюлозным полисахаридам, не относящимся к пектиновым веществам, поэтому в этот класс попадают и те полимеры, функции которых не совсем ясны, например глюко(галакто) маннаны. Раньше все эти полисахариды называли гемицеллюлозы, что означает «полуцеллюлозы» и совсем не отражает их состав и функции. Разграничение этих полимеров с пектиновыми веществами по наличию или отсутствию уроновых кислот также не совсем абсолютно, поскольку некоторые из связующих гликанов содержат уроновые кислоты, хотя и в минорных количествах. Путаница с подобной терминологией полисахаридов клеточной стенки приводит к тому, что исследователи пытаются использовать другой тип классификации – по экстрагируемости полисахаридов различными растворами. Например, «фракция, растворимая в оксалате аммония», или «фракция, растворимая, в уксусно-азотном реактиве». Эта классификация вполне корректна, но, кроме неблагозвучности, обладает тем недостатком, что не дает представления о том, какие именно полисахариды в нее входят, поскольку у различных растительных образцов одним и тем же растворителем могут извлекаться разные полимеры. С другой стороны, один и тот же полимер может попадать в различные фракции из-за наличия или отсутствия у его молекул связей с другими компонентами клеточной стенки. Предпочтительным, конечно, является перечисление индивидуальных полисахаридов, а не несколько безликой группы полимеров, но такая характеристика является достаточно трудоемкой и выполнена лишь для ограниченного круга объектов. И все же отнесение полисахарида к той или иной группе дает его первичную характеристику и ориентиры в возможных функциях.