Специфичность фермента амилазы (стр. 4 из 5)
Рис. 1 Действие конкурентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу). Е - фермент; S - субстрат; Р1 и Р2 - продукты реакции; I - ингибитор.
Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.
Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин, действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологические процессы в организме. Применение подобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстрат связывающих центров ключевых ферментов обмена.
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.
Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.
Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом.
Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса.
Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэлиса-Ментен, Лайнуивера-Бэрка или другими, например уравнением Эди-Хофсти:
ν = -Km(y/[S]) + Vmax
и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.
Рис. 2. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного ингибитора.
а - в координатах v от [ S ] ; б - в координатах 1/v от 1 / [ S ] ; Vmaxи Vi - максимальные скорости реакции; Кm и Kmi - константа Михаэлиса соответственно в отсутствие (1) и в присутствии (2) ингибитора.
Рис. 3. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии неконкурентного ингибитора.
При конкурентном типе ингибирования ингибитор увеличивает значение Кm, не оказывая влияния на максимальную скорость Vmax. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [ S ] ингибитор вытесняется молекулами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.22) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина Кm не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, наблюдается смешанный тип ингибирования, иногда называемый частично неконкурентным, или обратимым неконкурентным ингибированием (см. ранее), при котором снижение Vmax сочетается с одновременным увеличением значений Кm. Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т.е. способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталитическому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата. Для этого типа торможения был предложен, как отмечено ранее, довольно неточный термин «бесконкурентное ингибирование». Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса EIS.
2. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследование воздействия внешних факторов на амилазу слюны1. Специфичность амилазы слюныМетодика приготовления разбавленной слюны:Прополоскать рот два раза дистиллированной водой для удаления остатков пищи. Взять в рот 20 мл. дистиллированной воды, держать её во рту около двух минут. полученную жидкость слить в стакан или колбу. Жидкость представляет собой раствор слюны, содержащий амилазу-фермент.Ход работы:В 2 пробирки добавить по 20 капель раствора крахмала, в 3-ю- 20 капель раствора сахарозы.В первую пробирку налить 10 капель дистиллированной воды, во вторую и в третью пробирки добавить по 10 капель разведенной слюны. Содержимое пробирок перемешать встряхиванием и поместить пробирки в водяную баню с температурой 37-40’ С. Через пять минут пробы разделить пополам и проделать реакции с йодом (для чего добавить в каждую пробирку по 1 капле раствора йода в йодистом калии) и с фелинговой жидкостью (добавить по 5 капель фелинговой жидкости).Результаты отражены в таблице 1 Таблица 1| № пробирки | Субстрат | фермент | Реакция с йодом | Реакция с Фелинговой жидкостью | |
| До | После | ||||
| 1 | крахмал | бесцветный. | Сине-фиолетовое окрашивание (со временем исчезает) | - | |
| 2 | крахмал | амилаза | Бесцветный | - | |
| 3 | сахароза | амилаза | бесцветный | Голубой оттенок (со временем не исчезает) | - |
Реакция гидролиза крахмала на субстрате с участием фермента амилаза прошла, о чем свидетельствует положительная проба с Фелинговой жидкостью, и отрицательная с реактивом Люголя. Амилаза катализирует гидролиз крахмала, сахароза не катализирует гидролиз крахмала. Реакция гидролиза крахмала с участием амилазы
Обнаружение продуктов гидролиза крахмала
Реакция с жидкостью Фелинга:
Реакция с реактивом Люголя:
2.Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы.
Ход работы:
В 3 пробирки налить по 5-10 капель разведенной слюны. В первую пробирку добавляют 1 каплю хлористого натрия (NaCl), во вторую -1каплю раствора сернокислой меди (CuSO4), в третью – 1 капли воды. Затем в каждую пробирку прилить по 5 капель раствора крахмала. Все три пробирки на 2-3 минуты поместить в водяную баню при температуре 37-40 С. Добавит в каждую пробирку по 1 капле раствора йода в йодистом калии.
Результаты отражены в таблице 2 Таблица 2| № пробирки | Фермент | Эффектор | Субстрат | Реакция с йодом | наблюдения |
| 1 | Амилаза | NaCl | Крахмал | Синие окрашивание | Прозрачн. |
| 2 | Амилаза | CuSO4 | Крахмал | Синие окрашивание | Синие окрашивание |
| 3 | Амилаза | Н2О | Крахмал | Синие окрашивание | Бледно-голубое окрашивание |
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Благодаря своей функции разнообразные ферменты обеспечивают быстрое протекание в организме огромного числа химических реакций. В настоящее время выделены и изучены сотни ферментов известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию.Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для многих практических отраслей химической, пищевой и фармацевтической индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, витаминов и многих других биологически активных веществ, используемых в народном хозяйстве и медицине
Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. Благодаря каталитической функции разнообразные ферменты обеспечивают быстрое протекание в организме и вне его огромного числа химических реакций.