Разработка методов и средств реабилитации объектов отравляющих веществ (стр. 5 из 8)
К слабозагрязненным относят почвы, в которых содержание химических веществ не превышает ПДК, но выше естественного фона.
Коэффициент концентрации загрязнения почвы НС вычисляется по формуле:
где С – общее содержание загрязняющих веществ;
Сф – среднее фоновое содержание загрязняющих веществ;
Спдк – предельно-допустимое содержание загрязняющих веществ.
Степень устойчивости почвы к химическим ЗВ оценивают по отношению к конкретному токсиканту или группе веществ, которыми загрязнена исследуемая почва. По степени устойчивости к химическим загрязняющим веществам и по характеру ответных реакций почвы подразделяют на: очень устойчивые; среднеустойчивые; малоустойчивые.
Степень устойчивости почвы к химическим загрязняющим веществам характеризуется следующими основными показателями: гумусного состояния почв, кислотно-основными свойствами; окислительно-восстановительными свойствами, катионно-обменными свойствами, биологической активности, уровня подземных вод, доли веществ в почве, находящихся в растворимой форме.
1.4 Микроорганизмы-деструкторы фосфорорганических соединений
Способность микроорганизмов использовать фосфорорганические соединения с С–Р связью в качестве единственного источника фосфора известна сравнительно давно [32]. Впервые доказательство биологического расщепления С–Р связи было получено на примере E. coli, которая в качестве единственного источника фосфора использовала метилфосфоновую или этилфосфоновую кислоты.
Анализ опубликованных к настоящему времени работ свидетельствует о наличии в природе широкого круга микроорганизмов – деструкторов фосфонатов, среди которых грам-положительные и грам-отрицательные бактерии, а также некоторые дрожжи и грибы [33-36]. Однако предполагается, что разлагать фосфонаты способны, скорее, только особые штаммы, но не определенные группы микроорганизмов [37]. Попытка проверить это была предпринята в ряде исследований [33]. Так, из пяти почвенных изолятов были выделены бактерии, способные деградировать широкую группу структурно различных фосфонатов. Прежде всего, это различные штаммы Pseudomonas и Bacillusmegaterium, разлагающие 14 из 15 исследованных субстратов, что сопоставимо с широкой субстратной специфичностью, выявленной ранее для Agrobacteriumradiobacter. В этой работе впервые было показано, что грам-положительные бактерии могут осуществлять прямое разложение связи С–Р. Способность расти на различных природных и ксенобиотических фосфонатах, как единственных источниках фосфора была проанализирована так же у микроорганизмов из семи экосистем и у 19 лабораторных микроорганизмов. Это исследование показало присутствие деструкторов фосфонатов среди различных бактериальных видов и систематических групп, выделенных как из загрязненных, так и из незагрязненных фосфонатами источников окружающей среды. Это свидетельствует о более широком их распространении, чем предполагалось ранее [34]. Было подтверждено отсутствие способности к деградации фосфонатов эукариотическими организмами. Впервые обнаружена такая способность у фотосинтетического организма Rhodobactercapsulatus. Недавно были выявлены галофильные бактерии Chromohalobactermarismortui, которые способны использовать для роста в качестве единственного источника фосфора фосфоноацетат, 2-аминоэтил-, 3-аминобутил-, метил- и этил- фосфонаты. При этом наблюдались различия в росте клеток на разных фосфонатах и их различная утилизация в зависимости от концентрации NaCl, что, возможно, является результатом использования клетками для этой цели различных транспортных систем. Термофильные бактерии GeobacilluscaldoxylosilyticusT20 способны также использовать некоторые фосфонаты в качестве единственного источника фосфора для роста при 600С. Некоторые штаммы Streptomycetesспособны использовать в качестве единственного источника фосфора самые различные по структуре фосфонаты. Штамм StreptomycesmorookaensisDSM 40565 способен расщеплять 2-амино-4-фосфонобутират в качестве источника азота и фосфора способом, подобным стереоселективному. Эти результаты позволяют предположить наличие нового метаболического пути для расщепления С–Р связи.
Только микроорганизмы, разлагающие алкилфосфонаты с образованием алканов, можно с уверенностью отнести к микроорганизмам, содержащим С–Р лиазу, хотя их субстратная специфичность может и не ограничиваться алкилфосфонатами. Некоторые из указанных микроорганизмов способны разлагать и другие фосфонаты, в том числе глифосат и 2-АЕР (таблица 5).
Большинство бактерий, для которых точно установлено разложение фосфонатов по С–Р лиазному механизму, относится к грам-отрицательным бактериям, однако, известны и два представителя грам-положительных бактерий: Arthrobactersp. GLP-1 и B. megaterium. Среди почти сорока идентифицированных почвенных изолятов и коллекционных штаммов бактерий, проверенных на С–Р лиазную активность, только вышеупомянутые грам-положительные бактерии обладали ею. У других исследованных грам-положительных бактерий С–Р лиазную активность обнаружить не удалось. Еще одним представителем бактерий, разлагающим фосфонаты по С–Р лиазному механизму, является Rhodobactercapsulatus, фототрофная грам-отрицательная бактерия, способная разрушать С–Р связь при анаэробных условиях на свету. Поиск С–Р лиазной активности среди представителей грибов (Cladosporiumherbarum, Fusariumculmorum и Trichodermaviride /33/ не дал положительных результатов.
Таблица 5 - Микроорганизмы, разлагающие фосфонаты по С-Р лиазному механизму
| Микроорганизм | Утилизируемый фосфонат | ||||
| Pn | 2-AEP | Ф-P | глифосат | ||
| Agrobacterium radiobacter | + | + | + | + | |
| Kluyvera ascorbata | + | + | + | - | |
| Kluyvera cryorescens | + | + | + | - | |
| Klebsiella oxytoca | + | + | + | - | |
| Klebsiella pneumoniae | + | + | + | - | |
| Bacillus megaterium 2BLW | + | + | + | + | |
| Arthrobacter sp.GLP-1 | + | + | + | + | |
| Rhizobium sp. | + | + | + | - | |
| Pseudomonas testosteroni DSM 1622 | + | + | - | - | |
| Pseudomonas sp. 7NSK2 | + | + | + | - | |
| Pseudomonas sp. PG2982 | + | + | + | + | |
| Escherichia coli DSM1576 | + | + | - | - | |
| Alcaligenes eutrophus | + | + | + | + | |
| Rhodobacter capsulatus | + | + | + | - | |
| Klebsiella aerogenes | + | + | + | - | |
| Enterobacteraerogenes | + | + | + | слабо | |
Таким образом, способность разлагать фосфонаты по С–Р лиазному механизму встречается среди грам-отрицательных бактерий гораздо чаще, чем среди грам-положительных бактерий. Это отдельные представители классов Arthrobacteriaceae, Bacillaceae, Rhodobacteriaceae, Alcaligenaceae,Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera) и Rhizobiaceae (Rhizobium, Agrobacterium).
Наряду с вышеупомянутой классификацией бактерий, способных разлагать фосфонаты по С–Р лиазному пути, делящей все бактерии на грам-положительные и грам-отрицательные, имеет место и другая классификация. Согласно ей бактерии, способные расщеплять С–Р связь с помощью С–Р лиазы делят на три класса [38]. Первый класс бактерий представляет собой Escherichiacoli, способная разлагать алкил- и фенилфосфоновую кислоты, но не глифосат. Второй класс бактерий представляет Enterobacteraerogenes, способная эффективно разлагать алкил- и фенилфосфоновую кислоты, однако глифосат разлагает слабо. Третий класс бактерий представляет собой Pseudomonas-подобные организмы, способные разлагать алкил- и фенилфосфоновую кислоты и глифосат одинаково эффективно. Однако С–Р лиазную активность внеклеточных экстрактов как у Escherichiacoli так и у Pseudomonassp. PG2982 тестировать не удалось [39, 40].
2. Основная часть
2.1 Методика отбора штаммов микроорганизмов, способных
растворять фосфорорганические соединения
Отбор штаммов проводили по методике, представленной в [41].
Музейную культуру, хранящуюся в холодильнике при t 4-80С на агаризованной среде, наносят на твердую минеральную среду с добавлением раствора глюкозы и метилфосфонатов кальция, железа и алюминия и выращивают посевной материал в течение 3-4 суток при t 28-290С. Затем по образующимся ореолам прозрачности вокруг нанесенной культуры отбирают штаммы микроорганизмов, способные улучшать растворимость метилфосфонатов.
Состав питательной среды:
В состав среды входят следующие соли (г/л): NH4Cl – 10,0; MgSO4x7H2O – 2,0; NaCl – 1,0; агар – 20г; трис(гидроксиметил)аминометан – 1,0.
Источник углерода – 40 % раствор глюкозы из расчета 1мл/л.
20 мл питательной среды переносят в пробирку и добавляют метилфосфонаты в виде взвеси концентрацией 1 г/мл.
2.2 Методика культивирования микроорганизмов
Используют стандартную методику культивирования с использованием органофосфонатов в качестве источников фосфора.
Для культивирования микроорганизмов используют среду MS1.
В состав минеральной части среды входят следующие соли (г/л): NH4Cl – 2,0; MgSO4x7H2O – 0,2; K2SO4 – 0,5 и микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O – 2,5; CaCl2x6H2O – 10,0; CuSO4x5H2O – 2,0; H3BO3 – 0,06; ZnSO4x7H2O – 20,0; MnSO4xH2O – 1,0; NiCl2x6H2O – 0,05; Na2MoO4x2H2O – 0,3.
Источник углерода – глутамат Na 10 г/л.
Источник фосфора – МФК или метилфосфонаты в концентрации 0,3 г/л. Кислые эфиры – в концентрации 0,2 г/л.
Для приготовления минеральной среды MS1 по 10 мл стоковых растворов 1-5 последовательно вносят в 0,5 л дистиллированной воды, тщательно перемешивая после добавления каждого из них, доводят рН до 6,5 20% NaOH и добавляли дистллированную воду до 1 л. Среду разливают по 100 мл в колбы для культивирования и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм 30 мин. В стерильную среду перед засевом бактерий вносят 70 мл стерильного стокового раствора 1М глутамата Na, 300 мл МФК на 1 литр среды. Начальное значение рН среды должно составлять 7.0-7.5.