Рисунок 3. Схема измерения проводимости тонкопленочного биосенсора, где I - рабочий электрод, II - электрод сравнения.

В ходе эксперимента авторы измеряли зависимость амплитуды исходного сигнала от концентрации субстрата. Для создания биоматрицы готовили растворы фермента и БСА в 20 мм калий-фосфатном буфере с рH=7,4 с конечными концентрациями 50-100 мг/моль и смешивали в соотношении 1:1, соответственно. Каплю смеси "фермент + БСА" наносили на поверхность одной пары электродов. На поверхность второй пары наносили раствор чистого БСА (электрод сравнения). Для полимеризации электроды окунали в атмосферу насыщенных паров глутарового альдегида на 30 мин., потом подсушивали мембраны на воздухе. Сигнал от электрода с мембраной БСА, которая расположена на том же кристалле, вычитался из сигнала на электроде с ферментативной мембраной. Разработанный биосенсор позволил определить глюкозу и мочевину в крови.

Во многих случаях для выявления биологической (в первую очередь, ферментативной) активности бактерий можно использовать амперометрические системы проточного инжекционного анализа и миниатюрные электрохимические детекторы. В этих случаях необходимо использование перистальтического насоса. Повышение скорости омывающего рабочий электрод анализируемого потока раствора приводит к увеличению регистрируемого сигнала [8].

1.2 Биосенсоры - принципы конструирования

биосенсор селективность биоэлектрохимический раствор

При конструировании тонкослойных биосенсоров стоит учитывать четыре основных фактора: 1) химическую и физическую природу ионселективной пленки; 2) характеристики оптических материалов; 3) особенности конструирования электрохимической ячейки; 4) тип аппаратуры, которая регистрирует.

Ионселективная тонкая пленка должна обеспечивать предыдущее концентрирование анализируемого вещества, подавление препятствий со стороны сопутствующих веществ, быть оптически прозрачной на измерительной длине волны света и электрохимически неактивной в определенном диапазоне потенциалов. При этом она не должна вступать в химическое взаимодействие с подкладкой из ITO, должна быть тонкой и однородной. Две из наиболее часто используемых подкладок представляют собой оксид кремния (SiО2), который готовится по методу "золь-гель", и поливиниловий спирт. Используют также нафионные пленки или ядерные лавсановые фильтры без добавок [9]. В них вводят иономеры, которые создают ионообменные кластеры. В качестве иономеров используют полати(диметил диалиламмониевый хлорид) - ДД, полати(винилбензил триметиламмоный хлорид) - ВТХ, четвертичный полати(4-винилпиридин) 4В и полиакриловую кислоту - ПК. Оптимальная толщина пленки, которую наносят, 400 - 700 нм. Ранее (рис. 3.) представлена схема, которую рационально использовать при конструировании такого биосенсора. В литературе описаны сенсоры для определении аммиака и хлора с калиевым ионообменным стеклом ВК7, используемым в качестве оптически прозрачного плоского волновода. Возможности биосенсорной характеристики биологических, физико-химических, биохимических, биоматематических и фармако-клинических реакций поистине не ограниченные.

1.3 Применение биосенсоров

Наряду с созданием новых поколений биосенсоров для определения токсичных газов [10], полиэлектролита [11], разрабатываются полимерные платформы для энзимов, ДНК электродов [12]. В последнее десятилетие получили развитие работы, направленные на создание микробных биосенсоров с иммобилизированными бактериями [6]. Разрабатываются зонды для идентификации нуклеиновых кислот и других макромолекул (рис. 4) [6, 13].

Рисунок 4. Золотой многоэлектродный сенсор для определения множественного взаимодействия антиген-антитело.

Электрохимическую импедансную спектроскопию (ЭИС) в соединении с золотыми рабочими массивами (рис. 4) использовали для определения множественных взаимодействий антиген-антитело. Характеристики биосенсора определялись поверхностью антигена гепатита В (HbsАg). Участок биосенсора был подготовлен в результате иммобилизации антител на покрытую молекулами поверхность электродов. Были получены линейные зависимости сопротивления переноса электронов и концентрации HbsАg в диапазоне от 10 пкг•моль^–1 до 1 нг•моль^-1 с границей выявление 10 пкг• моль^-1. Последующее развитие получили работы по созданию глюконометров [13]. Для анализа соединения крови непосредственно в артериях и венах уже используется новое поколение иглообразных электродов из легированных сталей и индивидуальных индифферентных металлов (Au, Pt, Ti, Mo) специальной конструкции [14]. Одним из перспективных направлений развития биосенсорных технологий есть использование в них высокопроводящих полимерных пленок, которые удерживают комплексы с переносом заряда на основе солей TCNQ [15].

РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы

2.1 Автоматический вычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс для исследования биоэлектрохимических межфазных границ

Для проведения эксперимента биоэлектрохимии необходимы как медленная регистрация вольтамперных и хроноамперных зависимостей, с чем, естественно, справляется потенциостат ПИ 50.1.1 укомплектованный потенциометрами марок ЛКД или ППД, которые пишут, так и их быстрая регистрация. Однако, поскольку механизм записи циклической вольтамперной зависимости (ЦВАЗ) потенциометрами марок ЛКД или ППД является механическим, то скорость быстродействия их небольшая и, естественно, они не могут перекрыть весь рабочий диапазон работы потенциостата ПИ 50.1.1, управляемого от внешнего генератора П – 8. При необходимости регистрации ЦВАЗ со скоростями развертки потенциала, которые превышают 0.1 В/c, с достаточно высокой точностью, эти измерения оказываются искаженными и их недопустимо использовать для анализа экспериментальных результатов. В данной работе нами предложен подход, который дает возможность превратить потенциостат ПИ 50.1.1 с программатором ПР–8 в высокоэффективный автоматический вычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс (рис. 5) для исследования электрохимических и биоэлектрохимических межфазных границ и регистрации ЦВАЗ. С этой целью мы использовали осциллограф RigolDC 1022, который обладает необходимыми характеристиками. На вход Y мы вводим токовый сигнал j, на вход X сигнал напряжения U. В зависимости от целей эксперимента сигнал синхронизации может быть задан от любого из 8 шагов программатора. Запись экспериментальных данных осуществляется в файл. Записываются триады–время t, ток j и поляризация Е.

Рисунок 5. Автоматический вычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс для исследования электрохимических и биоэлектрохимических межфазных границ.

На примере измерений циклических вольтамперных зависимостей для разных межфазных границ, в широком диапазоне потенциалов поляризации и скоростей развертки по потенциалу, проверена работоспособность предложенной установки. Использование осциллографа RigolDC 1022 позволило (рис. 5) перекрыть весь рабочий диапазон параметров потенциостата ПИ 50.1.1.

2.2 Электрохимическая ячейка

Для єксперимента использовалась специально сконструированная фторопластовая электрохимическая ячейка, показанная на рисунке 6. Она отвечает всем требованиям, предъявляемым к измерениям электрохимических вольтамперных, хроноамперных и поляризационных исследований. Ячейка полностью герметична и предназначена для разнообразных нанобиоэлектрохимических исследований в инертной атмосфере аргона или гелия марки о.с.ч.

Рис. 6. Герметизированная ячейка для нанобиоэлектрохимических измерений: 1 – рабочий электрод; 2 – тефлоновая втулка; 3 – вспомогательный электрод; 4 – тефлоновый стакан; 5 – тефлоновая крышка; 6 – ввод для гелия; 7 – капилляр для отвода газов; 8 – стеклянный капилляр Лугина–Гебера; 9 – мешалка; 10 – электрод сравнения; 11 – компенсационный электрод.

Перед измерениями фторопластовую ячейку промывали раствором хромовой смеси, 1 М раствором Н₂SO₄, 24 ч. вымачивали в бидистиллированной воде, промывали раствором "пираньи" [16] для снятия всех органических загрязнений и потом трижды промывали дистиллированной водой.

Электрохимическая ячейка (рис. 6.) с четырьмя электродами: рабочим игольчатым Pt с поверхностью 0.53 см²; основным вспомогательным Pt, расположенным в отдельном отсеке, с площадью поверхности 0.45 см², диаметром 0.5 мм; вторым вспомогательным Pt – электродом, который использовался для увеличения быстродействия работы потенциостата. Электродом сравнения служил стандартный серебрянохлорный электрод сравнения (х.с. э.) с Е_ст = 0.226 В при 20 °С, находящийся в дополнительном отсеке и соединенный с отсеком рабочего электрода через тефлоновый шлиф, во избежание влияния Сl^– – ионов на электродный процесс. В качестве стандартного раствора для серебрянохлорного электрода использовали раствор насыщенного хлористого калия. Все потенциалы в данной работе приведены относительно х.с.э.

2.3 Электроды

Как материалы, используемые в подкладках сенсорных электрохимических устройств, используют чистые Pt, Au, SiО₂ и графитовые материалы квалификации о.с.ч. 00 или о.с.ч. 000. Биосенсоры для особых целей содержат подкладки из сверхчистых монокристаллов металлов или оксидов, которые содержат ориентированы индексные грани, например Pt (001), Pt (010) или Pt (111). Pt обладает рядом достоинств, таких как воспроизводимость электрохимических свойств поверхности электрода, возможность эффективного снятия с её поверхности адсорбированных примесей, широким электрохимическим окном – широкой двойнослойной областью потенциалов в растворах индифферентных электролитов (малые токи заряжания). Подготовка заключалась в выдержке Pt 00 в течении 20 мин. в концентрированной HNO₃, в тщательном промывании в бидистилляте. После этого снятие органических примесей и физических загрязнений осуществляли в растворе пираньи 1:1 (H₂SO₄ конц/Н₂О₂ 35%) при времени выдержки 40 мин, Т=20⁰С. Эта процедура приводила к повышению активности поверхности Pt–электрода. Такая обработка дала возможность снять адсорбированные вещества с поверхности электрода, растворить поверхностный оксид, стандартизировать подготовку электродов и добиться воспроизводимости измерений.