Конструирование биосенсора для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853 (стр. 3 из 6)
Для очистки Au и Pt электродов от загрязнений и органических примесей, антител и антигенов использовали раствор "пираньи", который включал серную концентрированную кислоту H2SO4 и перекись водорода H2O2 в соотношении 8:3. Электроды выдерживали в этом растворе в течение 30 минут при 40 0С.
Активацию Au и Pt электродов проводили в растворе концентрированной азотной кислоты.
2.4 Очистка и подготовка растворов
Все использованные в экспериментах реактивы Kсl, Nа2нро4, Нno3 были марки х.ч. Растворы готовили на дистиллированной воде. Очистку растворов осуществляли наложением прямоугольных импульсов потенциала на рабочий электрод от потенциостата ПИ 50.1.1, на внешний вход которого от внешнего программатора ПР–8 подавались управляющие импульсы напряжения прямоугольной формы. С помощью дозатора UNI 2010 готовили растворы АСКМ (сыворотки крови мышей, вакцинированных белковым полисахаридом фракцией синегнийной палочки) в PBS. Объем фонового раствора электролита PBS в ячейке составлял 40 мл.
Все измерения проводились при 20 0с. В качестве фонового раствора электролита был выбран фосфатный буферный раствор (PBS) следующего состава: 8 г/л NaСl, 0,2 г/л KСl, 1,44 г/л Na2НРО4, 0,24 г/л KН2РО4, рН = 7,4, приготовленный на бидистиллированной воде. Все потенциалы в работе приведены относительно стандартного серебрянохлорного электрода сравнения.
2.5 Стратегия создания биосенсора для регистрации P.AERUGINOSA АТСС 27853
Основываясь на мировых фундаментальных исследованиях создания и конструирования биосенсорных систем для регистрации разных бактериальных штаммов и экспериментальных работах [17-26] для создания биосенсора на P. aeruginosa АТСС 27853 была предложена следующая структурная схема построения трандьюсера:
Рисунок 7. Структурная схема построения трандьюсера.
РАЗДЕЛ 3. Результаты исследований
На рисунке 8 показана схема созданного нами биосенсора на P.aeruginosa АТСС 27853 с наноразмерной по координате электрохимической реакции биохимически активной мембраной.
Рисунок 8. Схема компановки биосенсора с нанопреходами по координате электрохимической реакции для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853.
Взаимодействие антиген-антитело приводит к изменению электростатических характеристик ДЭС, следствием чего является рост тока во внешней цепи электрохимической ячейки.
Поскольку большая доля биосенсоров, в состав которых входит трандьюсер, является электрохимическими устройствами, то их работоспособность и воспроизводимость измеряемых данных в значительной мере зависит от материала рабочего электрода, его чистоты. Для массового производства биосенсоров можно использовать Pt о.с.ч. 00 и Au о.с.ч. 00.
Нами проведено изучение электрохимического поведения Pt о.с.ч. 00 и Au о.с.ч. 00 в фосфатном буферном растворе (PBS),который использовался в качестве поддерживающего электролита. На рис. 9 показаны ВАХ (вольтамперные характеристики) от межфазной границы раздела Pt/ PBS в зависимости от скорости развертки (V/s) по потенциалу Е. При медленных развертках ЦВАЗ имеет один катодный максимум тока на катодной волне, а сами токи являются токами заряжения. С увеличением скорости развертки величина регистрируемых токов увеличивается, а токи определяются электрической емкостью ДЭС (двойного электрического слоя) межфазной границы. При больших скоростях развертки по потенциалу на ЦВАЗ не наблюдается токовых максимумов, а анодный и катодный ток плавно увеличивается или уменьшается в зависимости от потенциала. Анодная и катодная зависимости ВАХ обусловлены двумя процессами заряжения. Pt после подготовки активная, на что указывают большие анодные и катодные токи электродных процессов, которые реализовываются на ней. Однако форма и характер этих кривых указывает на то, что она находится в состоянии окисления. На рисунке 9 показаны ЦВАЗ при малых скоростях развертки по потенциалу в увеличенном масштабе по сравнению с рисунком 10. При самой медленной скорости развертки по потенциалу в диапазоне от 0.000 до 0.800 В через межфазную границу текут наноамперные токи, указывая на хорошую поляризуемость Pt электрода и на то, что для анодной волны протекают лишь токи заряжения.
Рисунок 9.ЦВАЗ Pt/ PBS. Рабочий электрод Pt 00. S = 0.53 см2. Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщен. KСl. Крутизна 1 мА/V. 1 – V/s = 5•100; 2 – V/s = 5•10-1; 3 – V/s = 5•10-2; 4 – V/s = 5•10-3.
Параметры потенциостата:
| mV | T | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
Рисунок 10. ЦВАЗ Pt/ PBS. Рабочий электрод – Pt 00. S = 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V. 3 – V/s = 5·10-2; 4 – V/s = 5·10-3.
Параметры потенциостата:
| mV | t | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(-2) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(-2) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(-2) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(-2) |
ЦВАЗ, полученную на Pt 00 после обработки в растворе концентрированной HNO3 и обработанную дополнительно в растворе пираньи, мы сравнили с ЦВАЗ, полученной на Pt 00 после обработки в растворе царской водки и обработанной в растворе пираньи (рис. 10). Сравнение кривых "1", "2" и "3" показывает, что в последнем случае поверхностный оксид снят с поверхности Pt 00, а ЦВАЗ, полученная в последнем случае, имеет два максимума тока. Первый, при потенциале 0,03 В, второй при потенциале 0,10 В характерных для адсорбции разных форм водорода в растворах кислот как на чистой платине, так и на разных индексных гранях в соответствии с работами Делахея. После нанесения на поверхность Pt 00 наномолекулярного слоя антитела к P. aeruginosa АТСС 27853 активность Pt 00 электрода подавляется рис.11, кривая "3". При катодных потенциалах восходящая ветвь ЦВАЗ на Pt электроде, который содержит 2 наноразмерных слоя антител совпадает с восходящими кривыми "1", "2". При анодных потенциалах эта же кривая 3 совпадает с кривой 4 как на восходящем, так и на нисходящем, участках ЦВАЗ. Таким образом, наноразмерный 2-молекулярный слой антител модифицирует поверхность Pt электрода и ограничивает минимальные токи, которые проходят через эту границу как в анодной области, так и в катодной. К этому факту мы вернемся позже, при обсуждении взаимодействия этой модифицированной межфазной границы с антигенами P. aeruginosa АТСС 27853. Важным является также тот факт, что на катодной волне пиков тока восстановления оксида Pt ни в одном из данных случаев не наблюдается. Это указывает на то, что поверхность Pt электрода ни в одном из них не окисляется. Форма и ход ЦВАЗ в фосфатном буфере зависит лишь от токов заряжения межфазной границы и обусловлена ориентацией молекул воды, ионов гидроксония и ОН – групп на поверхности электрода и количеством этих частей, которые вошли в ДЭС.
Рисунок 11. ЦВАЗ Pt/ PBS. Рабочий электрод Pt 00. S = 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100. 1 – чистая Pt обработанная в растворе конц. HNO3 40 мин. и потом в растворе пираньи; 4 – чистая Pt обработанная в царской водке 10 мин., затем в растворе пираньи; 3 – Pt/ 2 наномолекулярных слоев ІМ АСКМ/ PBS; 2 – чистая Pt обработанная в царской водке, в растворе конц. HNO3 40 мин., затем в растворе пираньи.
Параметры потенциостата:
| mV | t | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
Рисунок 12. ЦВАЗ Pt/ PBS . Рабочий электрод – Pt 00. S = 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100. а: 1 – в чистом PBS (pH = 7,4); 2 – с добавкою 0.32 мл раствораантигеновP.aeruginosa АТСС 27853 уPBS, τ = 1 мин.; 3 – 15 мин.
Параметры потенциостата:
| mV | T | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
Представляло интерес определить, изменяет ли характеристики ЦВАЗ, полученные на чистой Pt, введение в фосфатный буфер антигенов P. aeruginosa АТСС 27853. На рисунке 12 показаны, как ЦВАЗ, полученная от межфазной границы Pt/ PBS, (рис. 12. линия "1"), так и ЦВАЗ после введения в исходный раствор антигенов P. aeruginosa АТСС 27853 (рис. 12, линии 2, 3). Следует подчеркнуть, что данные, представленные на рис. 12 линией "1" и линиями "2" и "3", получены в независимых экспериментах. Из этого следует, что введение в исходный раствор антигенов приводит к появлению на анодных и катодных ветвях ЦВАЗ соответственно вольтамперометрических максимумов окисления и восстановления антигенов P. aeruginosa АТСС 2785. С увеличением времени контакта с электродом ток в их пиках растет. Адсорбция продуктов превращения P.aeruginosa АТСС 2785 при потенциалах положительней пика окисления и отрицательней пика восстановления растет, на что указывает уменьшение соответствующих токов в сравнении с токами, которые протекают в этих областях потенциалов в системе Pt/ PBS. Адсорбция этих продуктов с ростом времени выдержки платины в растворе растет.