Конструирование биосенсора для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853 (стр. 4 из 6)
Таким образом, присутствие Red/ox максимумов на ЦВАЗ, а, следовательно, и наличие стандартной ЭДС однозначно указывает на то, что они обусловлены именно введением в чистый раствор фосфатного буфера антигенов P. aeruginosa АТСС 27853. Следствием наличия Red/ox потенциала является то, что антигены P. aeruginosa АТСС 27853 в растворе электролита находятся в двух формах и непрерывно переходят друг в друга. Поэтому мы однозначно можем записать это динамическое равновесие в форме:
OxP.aeruginosa АТСС 27853 + ē = RedP. aeruginosa АТСС 27853. (6)
Таким образом, выясняется, что антигены P. aeruginosa АТСС 27853 в растворе находятся в двух разно заряженных Red и Ox формах, и именно эти формы переходят друг в друга, соударяясь из Pt индифферентным электродом, который является лишь переносчиком электронов между ними. Данные рисунка 12 позволяют найти стандартную ЭДС этой цепи:
. (7)Из курса электрохимии известно, что каждая электрохимическая редокс пара имеет свой, строго постоянный потенциал. Следовательно, стандартная ЕДС
это прирожденное свойство редокс форм антигенов P. aeruginosa АТСС 27853. Это важнейший признак, по которому может быть определено в электрохимической системе наличие антигенов P. aeruginosa АТСС 27853. В сущности Pt электрод уже является биосенсором на антиген P. aeruginosa АТСС 27853. Однако чувствительность такого биосенсора к ионам антигенов мала и составляет 1 ÷ 5•10–6 М•л–1. В тоже время такой биосенсор не является избирательным по отношению к антигенам P. aeruginosa АТСС 27853, поскольку на таком электроде в случае наличия в системе посторонних антигенов и других заряженных примесей могут начать протекать большие токи, которые замаскируют редокс пики от антигенов P. aeruginosa АТСС 27853.
Создаваемый нами реальный эффективный биосенсор должен быть избирательный именно к антигенам P. aeruginosa АТСС 27853. С этой целью необходимо так модифицировать рабочую поверхность биосенсора, чтобы она была избирательна лишь к анализируемому антигену и давала бы аналитический сигнал по крайней мере в 10 раз превышающий сигнал, полученный от чистого электрода Pt. Ниже мы опишем роботу модифицированных Pt и Au подкладок, которые нам удалось получить, и которые являются избирательными и более чувствительными по отношению к антигенам P. aeruginosa АТСС 27853.
Кроме Рt-подкладки для создания биосенсора нам предсталяется возможным использовать Au индифферентный электрод. В работе мы использовали два Au электрода: плоский электрод с большой поверхностью (S = 1.04 см2) и малый цилиндрический с площадью равной 0.306 см2.
На рисунке 13 показаны экспериментальные ЦВАЗ, полученные в фоновом электролите на малом цилиндрическом Au 00 электроде в зависимости от скорости развертки потенциала. Они указывают на то, что прохождение тока через межфазную границу Au/ PBS сложнее, чем для межфазной границы Pt/ PBS рассмотренной выше.
Рисунок 13. ЦВАЗ Au/ PBS. Рабочий электрод – Au 00. S = 0.306 см2. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки: 1 – V/s = 5·100; 2 – V/s = 5·10-1; 3 – V/s = 5·10-2.
Параметры потенциостата:
| mV | T | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
Аналогичная картина наблюдается и для Аu-электрода с большой поверхностью, данные для которой показаны на рисунках 14 – 15 при разных скоростях развертки по потенциалу.
Рисунок 14. ЦВАЗ Au/ PBS . Рабочий электрод – Au 00. S = 1.04 см2. Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщенный KCl. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки: 1 – V/s = 5·100; 2 – V/s = 5·10-1; 3 – V/s = 5·10-2.
Параметры потенциостата:
| mV | T | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
При малых скоростях развертки по потенциалу межфазная граница Au/ PBS приближается по своим электрохимическим свойствам к межфазного границе Pt/ PBS , хотя пик тока при потенциале 0,24 В (х.с.е.) присутствует на ЦВАЗ, но величины тока слабо зависят от потенциала при минимальной скорости развертки по потенциалу.
Для того чтобы понять, насколько чисто выполняется наш биоэлектрохимический эксперимент достаточно сравнить измерения ЦВАЗ выполненные на большом и малом
Рисунок 15. ЦВАЗ Au/ PBS . Рабочий электрод – Au 00. Крутизна 1 мА/V. 1 – Sб = 1.04 см2; 2 – Sм= 0,306 см2. Скорость развертки V/s = 5·100.
Параметры потенциостата:
| mV | T | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
На рисунке 15 представлено такое сравнение при одинаковых экспериментальных условиях и при одинаковой скорости развертки по потенциалу при пересчете ЦВАЗ на единичную площадь Аu-электродов. Полученные кривые практически совпадают. На большом пластинчатом электроде Au более выразительно выражен токовый максимум.
Некоторые отличия в величинах токов наблюдаем при анодных потенциалах. Такие небольшие отличия можно объяснить разной гидродинамикой и разным вкладом краевых эффектов на величину распределения тока на электродах с разной конфигурацией. Необходимо также учесть то, что пластинчатый электрод не равнодоступен для тока, который протекает через его разные участки. В целом же наблюдается практически полное совпадение этих ЦВАЗ. Таким образом, в наших экспериментах достигнута очень высокая чистота, воспроизводимость и точность экспериментальных данных.
Эта зависимость токов указывает на то, что нанесение на Pt и Au электроды 2 наномолекулярных слоев антител вполне достаточно для того, чтобы межфазная граница стойко функционировала как датчик биосенсорного устройства. При этом мера заполнения поверхности Pt и Au электродов двумя мономолекулярными слоями равняется 1, то есть вся поверхность модифицированных Pt и Au электродов закрыта антителами и внешней электродной поверхностью уже являются концы молекул антител к P. aeruginosa АТСС 27853. Создание на поверхности Au электрода мономолекулярных и полимолекулярных поверхностных слоев позволяет впритык подойти к получению биосенсоров. В соответствии с выбранной стратегией мы нанесли на поверхность пластинчатого электрода Pt с помощью специальных методов 2 наномолекулярных слоев антител АСКМ и иммобилизировали их к поверхности подкладки. ЦВАЗ снимали в фосфатном буферном растворе. На рисунке 16, линия "2" показывает отзыв межфазной границы Pt/ 2НАНО ИМ АСКМ / PBS на зондирование ее треугольными импульсами напряжения. Для сравнения на этом же рисунке (линия "2") приведена ЦВАЗ, полученная на чистом Pt электроде.
Рисунок 16. ЦВАЗPt/ 2НАНОІМАСКМ/ PBS. Рабочий электрод - Pt 00. S = 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100. 1 – чистая Pt (х = 0); 2 – Pt с х = 4НАНО ІМ АСКМ.
Параметры потенциостата:
| mV | T | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
Из сопоставления этих данных выходит, что 2 мономолекулярных слоя нанесенных на Рt-подкладку приводят к понижению токов что протекают через межфазную границу Pt/ 2НАНО ИМ АСКМ/ PBS. При этом вся ЦВАЗ от межфазной границы Pt/ 2НАНО ИМ АСКМ/ PBS расположена внутри ЦВАЗ от межфазной границы Pt/ PBS. Такое уменьшение токов в случае ЦВАЗ(2) обусловлено наличием на поверхности Pt подкладки хорошо связанных с ней антител АСМК, которые образуют физический барьер с определенным сопротивлением. Таким образом, падение прилагаемого напряжения происходит уже не только в области ДЭС, но и в наномолекулярной пленке. Именно оно определяет падение тока на межфазной границе Pt/ 2НАНО ИМ АСКМ/ PBS по сравнению с Pt/ PBS. Наиболее большие отклонения от исходной ЦВАЗ наблюдаются при катодных потенциалах как на ниспадающей, так и на растущей, ветвях ЦВАЗ. При анодных потенциалах эти ветви ЦВАЗ практически совпадают.