Конструирование биосенсора для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853 (стр. 5 из 6)
Рисунок17. ЦВАЗPt/ 2НАНОІМАСКМ/ PBS. Рабочий электрод - Pt 00. S = 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100. 1 – без P. aeruginosa АТСС 27853; 2 – сP. aeruginosa АТСС 27853, τ = 5 мин
Параметры потенциостата:
| mV | t | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
На рисунке 17 представлена ЦВАЗ (линия "2"), полученная от межфазной границы Pt/ 2НАНО ИМ АСКМ/ PBS через 5 мин. после введения в раствор фосфатного буфера антигенов P. aeruginosa АТСС 27853. Введение антигенов в систему приводит к росту токов при катодных потенциалах нисходящей и восходящей ветвей ЦВАЗ. Однако ожидаемых вольтамперометрических максимумов на ней не наблюдается. Поэтому рабочий электрод мы выдержали в PBS на протяжении 18 час. После этого опять произвели регистрацию ЦВАЗ.
Рисунок 18. ЦВАЗ Pt/ 2НАНО ІМ АСКМ/ PBS . Рабочий электрод - Pt 00. S = 0.53 см2. Насыщенный KCl. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100.1 – без антигенов P. aeruginosa АТСС 27853; 2 – сP. aeruginosa АТСС 27853, τ = 5 мин.; 3 – сP. aeruginosa АТСС 27853, τ = 18 часов.
Параметры потенциостата:
| mV | t | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
Эти данные представлены на рисунке 18 линией "3". Как видно из рисунка, при 0.380 В на анодной ветви ЦВАЗ появился вольтамперометрический максимум тока, а в катодном цикле этой же кривой образуется вольтамперометрический максимум тока восстановления антигенов P. aeruginosa АТСС 27853 при 0.130 В. Найденная из этих данных стандартная ЕДС равна 0.250 В. При сравнении ее с полученной раньше ЕДС для этой же Red/ox системы на чистом электроде Pt и пренебрегая Нернстовским концентрационным членом, получаем их практически полное совпадение. В то же время, токи анодного и катодного максимумов более чем в шесть раз превышают аналогичные токи для вольтамперометрических максимумов, полученных на чистой Pt. Для того, чтобы убедиться, что ток от биосенсора не меняется во времени мы продолжили измерения ЦВАЗ в этой системе. Все параметры измеренных вольтамперных зависимостей стойко повторяются в последующих циклах сканирования.
Рисунок19. Pt/ 2НАНОІМАСКМ/ PBS .
Рабочий электрод - Pt 00. S = 0.53 см2. Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщенный KCl. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100. 1 – Pt/ PBS; 2 – Pt/ 2НАНО ІМ АСКМ/ PBS; 3 – + антигены P. aeruginosa АТСС 27853, τ = 5 мин.; 4 – τ = 18 ч.; 5 – τ = 23ч.;6 – τ = 24ч.; 7 – τ = 25 ч. 45 мин.
Параметры потенциостата:
| mV | t | mV | S (V/s) | ||
| шаг 1 | 0 | 10 с | шаг 5 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 2 | 0 | 1 с | шаг 6 | 0 | 5·10(0) |
| шаг 3 | 0 | 1 с | шаг 7 | 1100 | 5·10(0) |
| шаг 4 | 0 | 1 с | шаг 8 | -300 | 5·10(0) |
На рисунке 19 показаны ЦВАЗ, полученные при больших временах выдержки Pt/ 2НАНО ИМ АСКМ в PBS, который содержит P. aeruginosa АТСС 27853. Для токов ЦВАЗ, показанных на этом рисунках, в анодной и в катодной областях потенциалов экспериментальные кривые как перед вольтамперометрическими пиками, так и за ними спадают и приближаются к току, полученному на этом же биосенсоре при отсутствии антигенов P. aeruginosa АТСС 27853. Этот факт является следствием того, что поверхность Pt подкладки модифицирована наномолекулярными слоями антител АСМК, а они избирательно отзываются лишь на взаимодействие комплементарных антиген – антитело. Таким образом, свойства биосесора определяют не Pt электрод и его структура электронных уровней, а наномолекулярный слой антител АСМК и их электронные уровни. Оказалось, что величина тока анодных и катодных пиков непрерывно растет с ростом времени нахождения биосенсора в фосфатном буферном растворе что содержит P. aeruginosa АТСС 27853: Pt / 2НАНО ІМ АСМК/ PBS, P. aeruginosa АТСС 27853 (8)
В электрохимических системах такой рост тока во времени наблюдается лишь для автокаталитических процессов. Такая же зависимость скорости реакции от концентрации субстрата характерна для ферментативных реакций и подчиняется кинетике Михаелиса–Ментен [7].
Оказывается, что и взаимодействие комплементарного наноразмерного слоя антител АСМК, определенным образом ориентированных в ДЕС, с ионами антигенов синегнойной палочки может быть описано аналогичного вида зависимостями (см. раздел 1.1.).
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что при определенных условиях биологически активные антитела или антигены принимают участие в процессе электрохимической самосборки наномембраны на инертных подкладках без участия α, ω-тиольного компоновщика.
2. В работе продемонстрирована возможность использования двухмерных наномембран на основе фрагментов F(AB`)2 FITC.как части устройства биосенсора для регистрации иммунного отклика антигенов АСКМ.
3. На Pt и Au электродах получены наномолекулярные пленки антител и антигенов. Проведенные исследования и анализ ЦВАЗ в системе Pt/ 2 наномолекулярных иммобилизованих слоев антител (сыворотки крови мышей, вакцинированных белковым полисахаридом фракцией синегнийной палочки, – АСКМ) в PBS з pH = 7,4, + х М P. aeruginosa АТСС 27853 (Pt/ антитело/антиген).
4. Обнаружены катодные и анодные пики токов специфического взаимодействия антитела с антигенами P. aeruginosa АТСС 27853.
5. Обнаружены катодные и анодные пики токов взаимодействия антигена P. aeruginosa АТСС 27853 в системе "чистая Pt/ PBS".
6. Сконструировано нанобиосенсор относительно комплементарного антигена P. aeruginosa АТСС 27853 и разработан электрохимический метод лабораторной индикации P. aeruginosa АТСС 27853.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Чмиленко Ф.О., Худякова С.М. Осмій–селективні електроди на основі метилтіопірондимеркаптидів. //Науковий вісник Черновецького університету. V Украинский съезд по электрохимии. Химия. 2008. – Випуск 401. –С. 199 – 201.
2. Ковальчук Є.П., Яцишин М.М., Ковалишин Я.С. Речовина в інтерфазі. Фізичнахіміятонкихплівок. ЛНУ. Львів. 2005. 225 с.
3. Хансен А.Г., Вакербарт Х., Нильсен Дж.У., Жан Ж., Кузнецов А.М., Ульструп Е. Межфазный электронный перенос в наномасштабе и с участием отдельной молекулы. // Электрохимия. 2003. – Т. 39. – В. 1. – С. 117 – 128.
4. Хейнеман, У.Р. Разработка новых тонкослойных спектроэлектрохимических сенсоров, избирательность которых реализуется тремя способами, и их применение [Текст]/ У.Р.Хейнеман, К.Дж.Селискар, Дж.Т. Ричардсон //Электрохимия. - 2003. – Т. 39. – В. 8. – С. 982 – 993.
5. Шеллер, Ф. Ферменты в электрохимических биосенсорах [Текст]/ Ф.Шеллер, Д.Кирштайн, Ф.Шуберт, Д.Пфайффер, К. МкНейл //Электрохимия. - 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1522 – 1527.
6. Сикейра, Ц.А.К. Перспективы сенсоров для оценки биологически индуцируемой агрессивности среды [Текст]/ Ц.А.К. Сикейра //Электрохимия. - 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1541 – 1553.
7. Шульга, А.А. Тонкоплёночные кондуктометрические энзимобиосенсоры для определения глюкозы и мочевины в крови [Текст]/ А.А. Шульга, С.В. Дзядевич, А.П. Солдаткин, С.В. Пацковский, Н.Ф. Стародуб, В.И. Стриха, А.В. Ельская //Электрохимия. - 1993. – Т. 29. – В. 8. – С. 998 – 1002.
8. Хитченс, Г.Д. Измерение бактериальной активности методом медиаторной амперометрии в проточно-инжекционной системе [Текст]/ Г.Д Хитченс, Д. Ходко, Д.Р. Миллер, О.Дж. Мурфи, Т.Д. Роджерс //Электрохимия. - 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1534 – 1540.
9. Тарасевич, М.Р. Электрохимические биосенсоры [Текст]/ М.Р. Тарасевич, В.А. Богдановская, Г.В. Жутаева //Электрохимия. - 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1554 – 1560.
10. Чвірук, В. Досягнення та перспективи розвитку у галузі електрохіммічних сенсорів для моніторингу повітряного середовища [Текст] / В. Чвірук /Труды III съезда по электрохимии. Вістник Львівського університету.- 2002. – В. 42. – Ч. 1. – С. 178 –181.
11. Чмиленко, Ф. Хімичні сенсори як засоби екологічного контролю вмісту поліелектролітів у водних розчинах [Текст] / Ф. Чмиленко, І. Коробова, О. Мікуленко /Труды III съезда по электрохимии. Вістник Львівського університету. - 2002. – В. 42. – Ч. 1. – С. 178 –181.
12. Ковальчук, Є.П. Полімерні платформи для ензимних електродів [Текст] / Є.П. Ковальчук, Б.Б.Остапович, З.Л.Турик, Є. Блажейовський /Труды IV съезда по электрохимии. Вістник ХНУ. 2005. – № 648. – С. 68 – 71.
13. Курись, Я. Матрична електрополімеризація – метод одержання поліанілину та поліпіролу, які чутливі до амінокислот [Текст] / Я.Курись, Н.Нетяга, В.Походенко /Труды III съезда по электрохимии. Вістник Львівського університету. -2002. – В. 42. – Ч. 1. – С. 138 – 141.
14. Масконе, Д. Иглообразные глюкозные биосенсоры для мониторинга IN VIVO [Текст] / Д.Масконе, Х.Яманака, М.Масчини //Электрохимия. -1993. – Т.29. – № 12. – С. 1528 – 1533.
15. Александров, Ю. Імпедана синтетичних металів на основі солей TCNQ [Текст] / Ю. Александров, О.Поспєлов, О.Шепеленко, А. Кравченко, Г. Камарчук //Труды III съезда по электрохимии. Вістник Львівського університету.- 2002. – В. 42. – Ч. 1. – С. 124 – 126.
16. Ge B., Huang Y.–C., Sen D., Yu H.Z. Electrochemical investigation of DNA-modified surfaces: From quantitation methods to experimental conditions. // J. Electroanal. Chem. 2007.– V. 602. – P. 156 – 162.
17. Джелали, В.В. БИОСЕНСОРЫ. /В.В. Джелали, А.Ю. Волянский. // Анналы Мечниковского института. 2006. – № 3. – С. 16 – 34.
18. Джелали, В.В. Механизм аномального растворения сталей. / В.В. Джелали, С.В. Нестеренко. // Украинский химический журнал. 2007. – Т. 73. – № 6. – С. 114 – 118.
19. Jelali, V.V. Semiconducting properties of DNA nanomolecular layer. /V.V. Jelali, A. Yu. Volyanskiy. // International Scientific Conferece. "Physical and Chemical Principles of Formation and Modification of Micro- and Nanostructures"FMMN’2007. P. С. 26 – 28.