Амилолитические ферменты (стр. 3 из 12)

В процессе образования и превращениях фермент-субстратных комплексов принято различать несколько стадий:

1. Присоединение молекулы субстрата к ферменту.

2. Последовательное превращение первичного фермент-субстратного комплекса в один или несколько активированных комплексов.

3. Отделение конечных продуктов реакции от фермента.

Специфичность, которую проявляют ферменты в отношении субстрата как при образовании фермент-субстратного комплекса, так и при каталитическом химическом превращении, обусловлена существованием в молекуле фермента специфического участка, называемого активным центром. Та часть активного центра, которая принимает непосредственное участие в каталитическом действии, получила название каталитического участка, а место, где осуществляется связывание фермента с субстратом, - контактного участка, или контактной площадки.

К 80-м гг. 20 в. был идентифицирован аминокислотный состав активных центров многих ферментов. В активный центр фермента могут входить аминокислотные остатки, сравнительно далеко отстоящие друг от друга в полипептидной цепи и сблизившиеся в результате ее ”перекручивания” при образовании вторичной и третичной структур ферментного белка. Так, в молекуле химотрипсина (протеолитического фермента животного происхождения) в состав активного центра входят остаток гистидина, находящийся в полипептидной цепи в положении 57, остаток серина в положении 195 и остаток аспарагиновой кислоты в положении 102.

Расположение аминокислотных остатков, формирующих контактный участок в молекуле фермента, способствует такому пространственному размещению субстрата, которое наиболее благоприятно для его атаки каталитическими (функциональными) группами активного центра. Например, реакция А + В

АВ, катализируемая соединениями, имеющие активные группы С, D и Е, в обычных условиях должна была бы происходить только в том случае, если бы одновременно столкнулись все пять реагентов. Вероятность такого столкновения ничтожно мала, поэтому скорость образования продукта реакции АВ в этом случае практически равна нулю. В том случае, когда эту реакцию катализирует фермент, требуется

только его взаимодействие с веществами А и В, поскольку группы С, D и Е уже включены в состав молекулы фермента. В результате эффекта близости реакционных групп в молекуле скорость катализируемой ферментом реакции увеличивается на несколько порядков. Кроме того, когда субстрат присоединяется к активному центру фермента, пространственная конфигурация молекулы субстрата изменяется и определенные химические связи в ней ослабевают.

Каталитическая активность фермента определяется структурой его молекулы в целом. Другие аминокислотные остатки, помимо входящих в активный центр, необходимы для формирования и стабилизации определенной конформации активного центра. Они также образуют участки, с которыми специфически взаимодействуют различные вещества, регулирующие активность фермента. В молекуле фермента имеются такие участки, за счет которых он может взаимодействовать с другими ферментами (при образовании мультиферментных комплексов) или белками мембран (мембранные ферменты).

Важнейшим свойством ферментов является их субстратная специфичность, т.е. способность не только ускорять реакции, но и избирательно катализировать лишь определенный путь превращения конкретного вещества – субстрата. По признаку специфичности действия все ферменты можно разделить на две группы:

1. Ферменты, обладающие абсолютной специфичностью.

2. Ферменты, обладающие относительной специфичностью.

Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно единственное вещество и катализирует только определенное превращение этого вещества. К абсолютной специфичности относят также стереохимическую (оптическую) специфичность. В живой природе встречаются лишь определенные пространственные формы соединений: аминокислоты в белках – только L-ряда, сахара – преимущественно D-ряда. Ферменты всегда действуют только на один из двух оптических изомеров вещества (L- или D-изомер). Специфичность ферментов может быть направлена и на другие типы стереоизомеров. Так, ферменты, действующие на транс-изомер, обычно неактивны в отношении цис-изомера того же вещества.

Наряду с ферментами, которым свойственна абсолютная специфичность, имеется большая группа ферментов, обладающих относительной или групповой специфичностью. Например, пепсин (протеолитический фермент животного происхождения) катализирует расщепление белковых молекул, которые могут существенно различаться друг от друга как по аминокислотному составу, так и по физико-химическим

свойствам. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная связь – CO – NH – .

2.1.5. Кинетика ферментативных реакций.

Скорость ферментативной реакции зависит прежде всего от природы фермента, который может обладать низкой или высокой ферментативной активностью, а также от концентрации субстрата, величины рН среды, температуры, присутствия ингибиторов или активаторов и др.

Установлено, что при прочих равных условиях и при наличии избытка субстрата начальная скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента.

Зависимость между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции графически можно выразить кривой, показанной на

рисунке 2.1.

Рис. 2.1. График, выражающий зависимость между скоростью ферментативной реакции (V) и концентрацией субстрата (S) при постоянной концентрации фермента: отрезок абсциссы К_м соответствует константе Михаэлиса (концентрация субстрата, при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной – V_макс).

Скорость реакции, соответствующая восходящей части кривой, пропорциональна концентрации субстрата (S); в верхней части кривой скорость реакции приближается к максимальному значению (V_макс) и почти не зависит от концентрации субстрата.

Исходя из представлений об образовании фермент-субстратных

комплексов в ходе ферментативной реакции Михаэлис и Ментен рассчитали весьма важную константу, позже названную константой Михаэлиса (К_м), которая в числовом выражении равна той концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т.е. когда в любой момент в комплексе с субстратом находится и половина молекул фермента). Таким образом, К_м является мерой сродства между ферментом и субстратом, причем низкие величины К_м свидетельствуют о высокой степени такого сродства.

Существует еще одна величина, характеризующая ферментативную реакцию, которая получила название ”число оборотов фермента”. Величина это показывает, сколько молекул субстрата превращается в продукты реакции за единицу времени в расчете на одну молекулу фермента.

Ферментативные реакции, подобно обычным химическим реакциям, ускоряются при повышении температуры. Установлено, что повышение температуры на каждые 10^о С увеличивает скорость ферментативной реакции в 1,5 – 2 раза (такая закономерность для большинства ферментов проявляется в интервале от 10 до 30^оС). Показано, что возрастание температуры на 1^оС повышает активность фермента на 4 – 10 %. Однако при температуре 50^оС и выше происходит постепенное снижение активности фермента. Дальнейшее нагревание (до 60 – 70^оС) приводит к постепенной денатурации и инактивации фермента. Степень инактивации зависит также от длительности температурного воздействия.

Ферменты весьма чувствительны к изменениям величины рН среды. Каждый фермент имеет оптимум рН, при котором он наиболее активен. Для большинства ферментов оптимальная величина рН близка к нейтральной ( рН=7,0). Таким образом, максимальная активность ферментов проявляется при физиологических значениях рН, а в кислой и щелочной средах их активность снижается. Из этого правила имеются, впрочем, исключения. Например, пепсин, содержащийся в желудочном соке активен лишь в очень кислой среде, а трипсин (протеолитический фермент животного происхождения, содержится в соке поджелудочной железы) при этих значениях рН полностью ингибируется. Оптимум действия трипсина лежит в пределах рН=8, т.е. в щелочной среде.

Кроме температуры, величины рН, концентрации субстрата большое влияние на активность ферментов оказывает присутствие ряда химических соединений. Одни из них повышают активность ферментов, другие, напротив, подавляют ее. Иногда, впрочем, соединения, являющиеся ингибиторами для одних ферментов, могут быть активаторами для других (чаще всего это относится к ионам металлов).

2.1.6. Ингибирование ферментов

Процесс ингибирования ферментов может быть обратимым и ингибирование ферментативных реакций. Конкурентное ингибирование возникает тогда, когда в среде одновременно присутствуют субстрат исходный по структуре с ним ингибитор (структурный аналог субстрата). В этом случае субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента.

Тормозящее действие конкурентного ингибитора на фермент зависит от концентрации субстрата. Если в окружении фермента находится много молекул субстрата и мало молекул ингибитора, то во взаимодействие с

активным центром фермента значительно чаще вступает субстрат. В этом случае ферментативная реакция не прекращается, а лишь замедляется. Если в инкубационной среде создать избыток субстрата, то конкурентное ингибирование прекращается.