В случае неконкурентного торможения (ингибирования) ингибитор не имеет структурного сходства с субстратом. Поэтому повышение концентрации субстрата не может привести к вытеснению ингибитора из комплекса фермент-ингибитор, как это происходит при конкурентном торможении.
2.1.7.Активация ферментов
Наряду с ингибиторами ферментов существуют также и активаторы ферментов. Весьма часто роль активаторов выполняют ионы металлов. Нередко действие иона металла в качестве активатора заключается в связывании субстрата с ферментом. В ряде случаев действие ионов металлов абсолютно специфично, т.е. для активации данного фермента требуется наличие определенного иона. Однако имеются ферменты, способные в одинаковой степени активироваться одними и теми же ионами металлов. Ион металла может являться постоянным компонентом активного центра фермента. Такие ферменты получили название истинных металлоферментов. В других случаях ион металла не связан постоянно с ферментом и может функционировать только как мостик между ферментом и субстратом. В этом случае образование фермент-субстратного комплекса идет ступенеобразно. Чаще сначала ион металла соединяется с ферментом, а затем уже возникает комплекс фермент-металл-субстрат.
В качестве активаторов ферментов могут выступать также цистеин, свободные SH-группы. Активирующий эффект подобных соединений заключается в том, что они восстанавливают дисульфидные связи (– S – S – связи) неактивного фермента с образованием свободных SH-групп, которые необходимы ферменту для проявления его каталитической активности.
Другим примером активации является превращение неактивных
предшественников ферментов (проферментов, или зимогенов) в активные ферменты. В этом случае в основе активации лежит гидролиз одной или нескольких пептидных связей в молекуле профермента под действием протеолитических ферментов. Так, в состав полипептидной цепи профермента трипсина (протеолитического фермента животного происхождения) – трипсиногена – входят 229 аминокислотных остатков. В результате гидролиза пептидной связи между 6-м и 7-м аминокислотными остатками от полипептидной цепи трипсиногена отщепляется N-концевой гексапептид, после чего создаются условия для формирования активного центра трипсина.
2.1.8. Единицы активности ферментов.
Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, потому что за редким исключением ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому непосредственно определяют не концентрацию фермента, а активность фермента. Об активности фермента судят по скорости ферментативной реакции, т.е. по скорости убыли субстрата или по скорости образования продуктов реакции.
Международный биохимический союз рекомендовал международную единицу активности фермента (МЕ). Одна международная единица соответствует тому количеству фермента, которое катализирует превращение 1мкмоль субстрата за 1мин. В оптимальных для этого фермента условиях. Однако МЕ не может считаться единицей системы СИ, т.к. минута является внесистемной единицей.
Единицей активности ферментов в СИ является катал (кат) и его производные (мкат и др.). Один катал – это количество фермента, которое необходимо для каталитического превращения одного моля субстрата за 1 сек.
2.1.9. Внутриклеточная регуляция ферментативной активности.
1) Простейший тип регуляции ферментативной активности, т.е. регуляции метаболических процессов, затрагивает основные параметры, влияющие на скорость ферментативной реакции (рН среды, температура, концентрация субстрата и коферментов, присутствие ингибиторов и активаторов). Например, любой процесс, способный изменить реакцию среды внутри клетки, может влиять на скорость той или иной ферментативной реакции. Если в норме концентрация субстрата в клетке ниже значения константы Михаэлиса, то скорость ферментативной реакции будет резко изменяться в зависимости от содержания субстрата.
2) Другой общий путь регуляции метаболических процессов обеспечивается действием т.н. аллостерических ферментов. Важные представления о механизме этого явления были сформулированы французскими исследователями Ф. Жакобом, Моно и Шанже в 1963 г. Они остулировали положение, согласно которому снижение или повышение активности ферментов invivo обычно является следствием изменения стерической конфигурации – конформации молекул фермента в результате присоединения соответствующих ингибиторов или активаторов, в роли которых выступают различные метаболиты, к другим, некаталитическим участкам фермента. Эти участки получили название аллостерических или регуляторных центров (греч. аllos – иной, другой). В результате присоединения ингибитора к аллостерическому центру фермента (аллостерический ингибитор) взаимодействие его активного центра с субстратом становится невозможным, несмотря на то, что активные группировки в каталитическом участке фермента остаются неблокированными. Напротив, под влиянием аллостерического активатора происходят такие изменения конфигурации активного центра, которые приводят к повышению каталитической активности фермента.
3) Третьим типом регуляции ферментативной активности является изменение концентрации фермента в результате стимулирования или ингибирования его биосинтеза либо изменения скорости его катаболизма.
4) Кроме того, существует еще регуляция ферментативной активности с помощью взаимозаменяемых форм ферментов. Например, фосфорилаза мышечной ткани, катализирующая расщепление гликогена, может находится в двух формах – (а) и (б). В физиологических условиях активной является преимущественно фосфорилаза в форме (а). Но, под влиянием некоторых факторов (под действием гормонов, например) фосфорилаза (а) может превратиться в фосфорилазу (б).
2.1.10.Методы определения активности ферментов
Прежде чем преступить к выделению фермента, необходимо избрать и тщательно отработать метод определения активности, под контролем которого производится выбор наиболее эффективных приемов очистки ферментов, а затем и выполнение последовательных стадий его препаративного получения. Активность фермента меняется при различных условиях реакции и зависит от температуры, рН среды, от концентраций субстратов и кофакторов. Учитывая это, при определении активности фермента на разных стадиях очистки необходимо строго соблюдать одни и те же условия. Желательно не ограничиваться определением активности по одному какому-либо методу. Количество субстрата, превращаемого в условиях теста по определению активности фермента, должно быть пропорционально количеству последнего и времени инкубирования. Если же нет такой пропорциональности, то активность рассчитывают по предварительно построенному калибровочному графику, отражающему зависимость скорости реакции от количества единиц фермента. Когда ход реакции не линеен во времени, следует определять начальную скорость реакции (по тангенсу угла наклона касательной к начальному отрезку кривой превращения). Для этого легче всего применять такие методы изменения активности, которые позволяют непрерывно следить за ходом превращения во времени: спектрофотометрические методы, потенциометрические, полярографические и т.п. Для измерения скорости ферментативной реакции необходимо выбрать буфер, который не тормозит исследуемую активность и обеспечивает поддержание рН раствора, близкой к оптимальной для данного фермента. Реакцию проводят при температуре, лежащей в большинстве случаев в пределах 25-400С. При исследовании ферментов, требующих присутствия кофакторов (ионов металлов, коферментов и др.), концентрация которых может снижаться по мере очистки фермента, в реакционную смесь следует добавлять недостающие кофакторы, например соли металлов, АТФ, НАДФ и т.п. Также для определения активности ферментов вводят стабилизаторы в состав опытных смесей. Во многих случаях добавление желатина, альбумина и других добавок предотвращает денатурацию ферментного белка.
Спектрофотометрические методы. Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Положение максимума поглощения при определенной длине волны определяется наличием в исследуемом материале определенных групп - аналитических форм. Для измерения спектров используют специальные приборы - спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры и др. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого реакционную смесь помещают в кювету, вставленную в термостатируемый кюветодержатель. Через малый промежуток времени после добавления фермента (или субстрата) и быстрого перемешивания измеряют поглощение при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта, образующегося в данной реакции. С помощью спектрофотометрического метода можно измерять непосредственно концентрацию некоторых ферментов (после достаточной очистки) по величине характерных максимумов поглощения прочно связанных коферментов (простетических групп). Необходимо иметь произвольно выбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения. В случае спектрофотометрического метода такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение в оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; если определяется продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в минуту, и т.д. Тогда удельную активность фермента, которая является мерилом чистоты ферментного препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка).