Механизм действия. К группе амилотических ферментов относятся a- и b-амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выраженной эндоамилазой является а-амилаза, способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.
Глюкоамилаза и b-амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.
При изучении механизма действия амилаз имеются определенные сложности, и прежде всего они заключаются в том, что субстрат - крахмал неоднороден и имеет различные характеристики по степени полимеризации гли-козидной цепи и количеству ветвлений.
Реакции, катализируемые амилазами, имеют две стадии: короткую -предстационарную и длительную - стационарную. Во время первой стадии эндоамилаза быстро уменьшает молекулярную массу субстрата, образуя смесь линейных и разветвленных олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йодом; он протекает значительно медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его природы. Поэтому конечные продукты гидролиза а-амилазами могут быть различными. Первая стадия воздействия фермента на субстрат хотя и носит неупорядоченный характер, имеет для всех видов a-амилаз схожий механизм.
Существует две гипотезы о механизме действия экзоамилаз на субстрат. Первая гипотеза предполагает, что, воздействуя на субстрат по одноцепочечному или «молниеобразному» механизму, экзоамилаза образует фермент-субстратный комплекс с захватом нередуцирующего конца цепи.
Дальнейшее продвижение фермента по этой цепи происходит до полного ее гидролиза. По второй гипотезе (b- и глюкоамилаза действуют на субстрат путем механизма множественной атаки, т. е. фермент образует комплекс с молекулой субстрата, затем через несколько этапов этот комплекс распадается и фермент связывается с новой молекулой субстрата. Иными словами, при множественной атаке происходит нечто среднее между неупорядоченным механизмом и одноцепочечной, «молниеобразной» атакой. Для полного гидролиза по этому механизму однамолекула субстрата должна образовывать много раз фермент-субстратные комплексы. При этом возможен гидролиз нескольких связей в одном каталитическом акте.
Механизм воздействия амилаз на субстрат может быть рассмотрен с нескольких позиций: вид разрываемой связи (a-1,4 или a-1,6); тип воздействия на субстрат (эндо- или экзо-); влияние на скорость гидролиза степени полимеризации субстрата;
4) возможность гидролиза олигосахаридов;
способность фермента к множественной атаке субстрата.
Наличие признаков амилаз, отраженных в 3 и 4 позициях, при действии на линейные субстраты может свидетельствовать о существовании у этих ферментов подцентровой структуры. Вероятно, активный центр амилазы может состоять из нескольких подцентров, каждый из которых может вступать в контакты с глюкозным остатком. Энергия взаимодействия (А;), выраженная в единицах свободной энергии (кДж/моль), определяет подцентровое сродство фермента к субстрату. Это сродство индивидуально и может быть как положительным, так и отрицательным. Вероятность существования подцентровых структур амилаз помогает установить строение активного центра амилаз, дает более четкое объяснение субстратной специфичности, но не дает объяснений механизма гидролиза разветвленных субстратов.
a-Амилаза. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1.) является эндоамилазой, вызывающей гидролитическое расщепление a-1,4-гли-козидных связей внутри высокополимеризованного субстрата. Фермент назван a-амилазой потому, что он высвобождает глюкозу в a-мутамерной форме.
a-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий М. м. 45 000-60 000. Своего рода исключением является a-амилаза В. macerans, которая имеет М. м. 130 000. Есть указания, что некоторые термостабильные a-амилазы имеют М. м. 14 000-15 000, но в их молекулах содержится в 2-3 раза больше атомов кальция.
Все а-амилазы относятся к металлоэнзимам, содержание в них Са колеблется от 1 до 30 г атом на 1 г моль фермента. Полное удаление кальция приводит к инактивации фермента. Повторное введение кальция в среду может частично восстановить его активность. a-Амилаза В. subtilis с помощью иона цинка способна образовывать димерную форму, чего лишены другие a-амилазы. Все a-амилазы устойчивы к воздействию протеаз. Они богаты тирозином и триптофаном. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты составляют 25% массы белка. Наличие этих кислот в а-амилазе связывают с их оса-харивающей способностью. Так, разжижающие a-амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Сравнительно мало или совсем отсутствуют в а-амилазах содержащие серу аминокислоты. Некоторые a-амилазы грибного происхождения имеют углеводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин, но функции его не установлены.
В зависимости от вида микроорганизма свойства ос-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности.
Действуя на целое крахмальное зерно, a-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия a-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются a-амилазой до ди- и моносахаридов.
Все a-амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же а-амилазы, особенно грибного происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с образованием небольшого количества мальтозы и глюкозы. Схему гидролиза под действием а-амилазы можно записать следующим образом:
а-Амилаза
Крахмал,----------------> а-Декстрины + Мальтоза + Глюкоза
гликоген (много) (мало) (мало)
b-Амилаза. b-Амилаза (a-1,4-глюкан мальтогидролаза, КФ 3.2.1.2) - активный белок, обладающий свойствами альбумина. Каталитический центр фермента содержит сульфгидрильные и карбоксильные группы и имидозольный цикл остатков гистидина. b-Амилаза -экзофермент концевого действия, проявляющий сродство к предпоследней b-1,4-связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы и амилопектина.
В отличие от a-амилазы b-амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием мальтозы b-конфигурации, поэтому данная амилаза по аналогии с a-амилазой называется b-амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Незначительное количество декстринов может образовываться при гидролизе «аномальных» амилоз, так как гидролиз b-амилазой идет только по линейной цепи до a-1,6-связей. Если субстратом для b-амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени. b-Амилаза отщепляет фрагмент с нередуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12 молекул мальтозы. Гидролиз приостанавливается на предпоследней a-1,4-связи, граничащей с a-1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значительное количество а-1,6-связей - так называемые b-декстрины. Действие b-амилазы на крахмал можно записать в виде следующей схемы:
b-Амилаза
Крахмал,----------------> Мальтоза + р-Декстрин
гликоген (54-58%) (42-46%)
b-Амилазы проявляют большую стабильность в отсутствие ионов Са2+.
Молекулярная масса b-амилазы растений достаточно высока, она составляет от 50 000 до 200 000. Фермент может состоять из одной или четырех субъединиц до 50 000 каждая. Фермент содержит SH-группы и чувствителен к действию тяжелых металлов. Считается, что (b-ами-лаза обладает высокой способностью к множественной атаке субстрата. Для амилозы средней молекулярной массы в одном присоединении фермента к субстрату возможно отщепление до четырех остатков мальтозы. При увеличении молекулярной массы субстрата возможно и большее количество мест атаки.
Глюкоамилаза. Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3.) широко распространена в природе. Она синтезируется многими микроорганизмами и образуется в животных тканях, особенно в печени, почках, плаценте кишечника и т. д. Фермент в литературе известен под различными названиями: амилоглюкозидаза, g-амилаза, лизосомальная a-глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза и экзо-1,4-a-глюкозидаза. Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков a-D-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и a-1,4-связь, гидролизовать a-1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за a-1,6-связью следует a-1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. Отличительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго- и дисахариды.
В литературе высказывается мнение, что механизм атаки субстрата глюкоамилазой может быть двух типов: либо одноцепочечный, либо множественной атаки, и что активный центр имеет подцентровую структуру.
Почти все глюкоамилазы являются гликопротеидами, содержащими от 5 до 35% углеводов, которые состоят из олиго-, ди- и моносахаридов. Углеводный компонент может быть целостным фрагментом или же разбитым на индивидуальные соединения, которые прикрепляются к белку через треонин и серин. Например, у глюкоамилазы A. niger их 20. Большинство известных глюкоамилаз имеет оптимум рН при 4,5-5,2, реже - при 5,7-6,0, в основном для дрожжевых глюкоамилаз.