Амилолитические ферменты (стр. 8 из 12)

Рис. 1. Пространственная структура глюкоамилазы

Результаты исследований влияния n-меркурибензоата на каталитическую активность глюкоамилазы позволяют сделать заключение о том, что в состав активного центра данного фермента не входят имидазольная группа гистидина и SH-группы, а в гидролизе крахмала принимают участие карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Используя данные рентгеноструктурного анализа и программу MolScript, методом молекулярного моделирования показано, что активный центр глюкоамилазы расположен в сквозной полости (~ 1,5нм), ограниченной следующими аминокислотными остатками: Leu-58, Leu-130, Leu-177, Leu-319, Trp-178, Trp-417, Phe-187 (рис1).

Установлено, что в гидролизе крахмала принимают участие карбоксильные группы Asp-55, Glu-179, Glu-400 (рис.2).

Активный центр фермента располагается в щели, прикрытой двумя кластерами молекул H₂O: первый - в области Leu-58 (12 молекул H₂O), второй – в углублении активного центра (7 молекул). Показано, что с одной стороны щели активного центра сосредоточены Asp-55 и Glu-179, а с противоположной – Glu-400.

Результаты рентгеноструктурного анализа (Алешин А.Е. и др, 1994 [10]) показали, что поверхность молекулы глюкоамилазы гликозилирована: 10 аминокислотных остатков серина и треонина имеют маннозу (Ser-453, Ser-455, Ser-459, Thr-457 и др.).

Данный фермент характеризуется наличием N-терминального домена, состоящего из 440 аминокислотных остатков, O-гликозилированного участка, имеющего 70 аминокислот и C-терминального крахмалсвязывающего домена (100 аминокислот). Каталитический домен имеет 2 N-гликозилированных участка, причем контакт между N-гликозилированными цепями и полипептидом стабилизируется остатком маннозы с помощью водородной связи или ионизированными молекулами воды, чем и определяется стабильность фермента и возможность образования надмолекулярных структур. O-гликозилированный домен имеет остатки Gly перед и после C-конца, которые представляют собой изгибы, определяющие взаимодействие крахмалсвязывающего домена с каталитическим и соответствующую ориентацию молекулы субстрата. Гликозилирование предотвращает скопление молекул субстрата в связывающих центрах и обеспечивает стехиометрическое связывание.

Рис. 2. Пространственная структура макромолекулы глюкоамилазы

Методом компьютерного моделирования установлено, что для молекул глюкоамилазы характерна плотная упаковка гидрофобного ядра в виде 13 α-спиральных участков (рис.3), а так же антипараллельных β-структур, образующих 11 петель (рис.4).

Рис. 3. Топология α-спиралей в макромолекуле глюкоамилазы

Рис. 4. Топология β-слоев в макромолекуле глюкоамилазы

Во вторичной структуре присутствуют, кроме того, неупорядоченные участки в количестве 19 (рис.5). В процентном соотношении данных структур по протяженности, аморфные участки преобладают над остальными, что подтверждено также методом ИК-спектроскопии (таблица).

Рис. 5. Топология неупорядоченных участков в макромолекуле глюкоамилазы

Таким образом, компьютерное моделирование позволяет получать дополнительную информацию о структуре белковых макромолекул и проводить расшифровку механизма ферментативного катализа.

В настоящее время продолжаются работы по проблемам изучения топологии различных амилолитических ферментов, таких как α-амилаза, β-амилаза, инулаза и др. Обсуждаются вопросы топологической самоорганизации исследуемых белковых макромолекул, определяемой взаимосвязью первичной и вторичной структуры.

4. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

4.1. Основные сведения

Микроорганизмы способны синтезировать разнообразные ферменты. В зависимости от состава питательной среды и условий культивирования они легко переключаются с синтеза одного фермента на синтез другого. У микроорганизмов сравнительно короткий цикл развития (10... 100 ч), вследствие чего можно получать сотни «урожаев» в год.

Продуцентами ферментов могут быть бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты. Для промышленного получения ферментных препаратов используют как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных сред, так и мутантные, отселекционированные в результате воздействия на природные штаммы физических и химических мутагенов.

Микроорганизмы синтезируют одновременно комплекс ферментов, но некоторые из них, особенно мутантные штаммы, продуцируют один фермент в значительных количествах. Для лучшего использования крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве осахаривающие материалы должны содержать не только амилолитические ферменты, но и ферменты, гидролизующие другие углеводы сырья — целлюлозу и гемицеллюлозы. Для обеспечения дрожжей азотистым питанием имеют значение и протеолитические ферменты.

Несмотря на то, что для успешного осахаривания нужен комплекс ферментов, отбор микроорганизмов-продуцентов до сих пор проводился главным образом по высокой активности амилолитических ферментов — a-амилазы и глюкоамилазы.

4.2. Микроорганизмы – продуценты ферментов

Наиболее часто в качестве продуцентов амилолитических ферментов в спиртовом производстве используют микроскопические грибы, реже — дрожжеподобные организмы и споровые бактерии.

4.2.1. Микроскопические грибы

Для получения амилаз широко применяют микроскопические грибы рода Aspergillus, видов: niger, oryzae, usamii, awamori, bata-tae, рода Rhizopus, видов: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные штаммы Neurosporagrassa и Mucor.

Микроскопические грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания — почва. Несмотря на наличие многих родов и видов микроскопических грибов, все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Они распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий, и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие- или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки — конидии.

Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит в стадию споро- или конидиеобразования. Споры и конидии микроскопических грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску.

Аспергиллы — типичные аэрофилы, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для большинства аспергиллов 25...30 "С, для некоторых — до 35 °С. Большинство грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40 °С и даже 45 °С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65 %.

Для питания аспергиллов необходимы углеводы, азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода, кроме моносахаридов, многих олиго- и полисахаридов, могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. В средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу, грибы не образуют амилазы. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты.

Среда должна содержать соединения, в состав которых входят сера, фосфор, калий, магний и микроэлементы. Большинство микроскопических грибов усваивают серу из сульфатов, а фосфор — из фосфатов. Аспергиллы не нуждаются в готовых витаминах и факторах роста, так как способны сами синтезировать их из более простых соединений, имеющихся в среде. Препараты ферментов из микроскопических грибов включают, как правило, широкий набор ферментов, поэтому могут полностью заменять зерновой солод.

На спиртовых заводах стали широко применять высокоактивный по глюкоамилазе штамм Asp. awamori 466 и ВУД-Т2, выращиваемые на концентрированном кукурузном сусле (18 % сухих веществ). Готовая культура имеет активность до 250 ед. ГлА на 1 мл, других ферментов образует мало.

4.2.2. Дрожжеподобные организмы

Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces.

В спиртовом производстве нашли применение End. bispora и End. species 20-9, выращиваемые глубинным способом и продуцирующие главным образом активную глюкоамилазу; ос-амилаз-ная активность проявляется слабо. Высокоактивный End. bispora имеет разветвленный мицелий, образует бластоспоры; гифы — септированные, зернистые; на твердых агаризованных средах образуют колонии с воздушным серовато-белым мицелием, на жидких питательных средах — гифы и некоторое количество бластоспор.